約 3,699,435 件
https://w.atwiki.jp/happyhappyhappyhappy/pages/57.html
質問対策 だいたいこんなもの？ こんなかんじ。 こんなかんじ。 ＦＬＩＭに最低限必要なこととは？ １．８０ＭＨｚのパルスレーザー ２．高感度の光電子増倍管 ３．ナノ秒オーダーで蛍光寿命を取得するハードウェア 脂質とプローブの関係はどうなっているのか？ 普通培養細胞は、１ｐｌくらいだと考えられています。 スパインの中は０．１ｆｌから０．０１ｆｌくらい 大体、１００倍くらいだと考えられます。 大体、ＤＡＧは、１ｆモルです。一細胞に。 だから、１０あぷとモルくらいある。（この計算はおかしい。神経の場合、スパインは特別だと考えられる） ＰＩＰ３の場合は、その１００倍くらい少ないから。１００ゼプト盛るくらいあります。これが、刺激によって１０倍くらいに変わるといわれています。 脂質プローブと脂質の結合能は、かなり高いですから、始めから結合していると考えられます。ここで、刺激が加わると、破壊分析の結果などを参考にしますと１０倍から最大で５０倍くらいの脂質ができます。これに、プローブが反応して応答するということになります。これは、プローブ全部を応答させるための量く シグナル伝達に関わるタンパク質は、タンパク質は、数十個あると言われている。よって、それに応答するPIP3も同様にそのレベルあるのではないかと推測します。プローブ分子は膜タンパク質で、蛍光を見ればわかるとおり、極めて量は少ないです。タンパク質の発現量は10-6Mくらいですから、スパインの容量が0.01flくらいだとすると、大体数十個くらいあると考えられます。よって、PIP3、プローブが大体数十個くらいずつあると想定してもらえれば大丈夫です。普通のPMTではなく、Gasp detectorを用いて観測しております。 1. In this presentation, you don t mention SHIP protein. How do you think SHIP protein is involved in this pathway? Thank you very much for good question. Exactly, SHIP is the protein that degrades PIP3 to PI(3,4)P2. I did not examine the effect of SHIP on spinule formation. Some paper shows that SHIP is not expressed in HP. Anyway it is very interesting to know the effect of SHIP on spinule formation. 1.0 How did you analyze spinule formation? It is pretty difficult that as you know spinule is very fine structure. So it is pretty difficult to observed. In our study we used the hamahoto H7422 Gasp detector. Spinules that protruded from the spine head were counted. Each synaptic spinule, regardness of its size and orientation, was scored as in previous studies (Tao-Cheng et al., 2009) And we did analyze the circularity. The effect of PTEN inhibitor, which increses PIP3, reduced the circularity. In the case of PI3K inhibitor, which decreases PIP3, there was the tendency that circularity increases but no significant difference. 1. 1. PIP3 or PIP2? very good question. This study is in the middle of revise. Reviewer pointed out about this point. I am looking for the protein of downstream of PIP3 such as Akt protein. And basically PIP2 is 100 times more than PIP3. even though PIP3 increase or decreases, PIP2 level is not reflected. So I think that PIP3 is the factor to regulate spinule formation. 1. 2. The relationship between schizophronia and PIP3 Inositol metabolism is deeply related to the depression and bipolar disorder. Because old days drug lithium is well known to work this pathway. currently it seems that lithium effects the GSK3beta. And PTEN mutant causes coden disease, which is accompanied by sometime mental reterdation. So PIP3 and inositol metabolism is related to the disease like these. But I think there is mainly two cause inositol metabolism regulates such a diseases. One is that PIP3 regulates the neuronal development in develop brains. The other is synapse function after neuron grown up. In the present study, I examined the effect of PIP3 on spine morphology. In near future, I want to examine the effect of PIP3 on neuron development. In some part, Dr. sheng reveal that PIP3 regulates the dendritic arborization though. 1.3 How about the mobility of PIP3 側方拡散lateral diffusion is roughly 1 microm/sec. But Dr. Kusumi shows that there is some barria mechanism which prevent the lateral diffusion of lipids. The molecules is surrounded by the fenses the size is 30 to 200 nm. So we cannot say that PIP3 is easily do the lateral diffusion. 1.4 PIP3 and raft Basically PIP3 fatty acid composition is steroyl and arachidonyl. 1.5 Did you try RNAi for PI3K and PTEN I tried PTEN RNAi. But I don t analyzed yet. 1.6 Did you check the decrease in PIP3 in the presence of PI3K inihibitor? Yes, I did it. I observed PIP3 reduction and increase in the presense of PI3K and PTEN inhibitor respectively in this figure. In the presence of PI3K inhibitor, PIP3 decrease more in spine than dendritic shaft. In the presence of PTEN inihibitor, PIP3 increase more in dendritic shaft than spines. Previously several paper shows that PTEN is localize in the dendritic shaft. Also some paper showed that PI3K is localized in spines and dendrites, but PI3K directly binds to AMPA receptors, leadting to PI3K activation. This data answers that why PIP3 is accumulated in the spines. 2. In the middle of glutamate uncaging, is PTEN related to this decrease? At first, I expect that PIP3 decrease during glutamate ungaging is due to PTEN. But I examined the effect of PTEN inhibitor on PIP3 decrease during glutatate uncaging. There is no obvious difference with or without PTEN inhibitor about PIP3 decrease. So I think this decrease of PIP3 is mainly due to menbrane insertion. 3. PTEN is dual phosphatase? Did you remove the possiblility PTEN phosphatase activity works in this pathway? Exactly PTEN has dual phosphatase activities. burabura. 4. PIP3 is involved in the functional plasticity? and structural plasticity? As I showd in introduction, there is no doubt that PIP3 regulates functional plasticity. 5. Does PIP3 regulate spinule length? Actually PIP3 regulates the number of spinule. But the length of spinule is not regulated by PIP3. 6. Explain the FLIM more. 7. What is the strength of FLIM compared to FRET? Previously I developed the ratiometric FRET probes including PIP3 and DAG probes. In the case of ratiometric-based FRET probe, in the thick tissues like hippocampal slice, wave-dependent fluorescence absorabance is gonna happen. We cannot measure appropriate FRET efficiecy. So I newly developed the florescence lifetime-based probe. Fluorescence lifetime never change even though thick tissues. That is the strength of FLIM. 8. PI3K works in the middle of glutamate uncaging? I did the experiment to see the effect of PI3K inhibitor on PIP3 concentration during glutamate uncaging. But there is no significant difference between with or without PI3K inhibitor. This means that enzymatic induced PIP3 is extremely little compared to dilution of PIP3 which is caused by membrane insertion. But if we want to observe more detail PIP3 dynamics which is caused by the PI3K or PTEN during glutamate uncaging, I plan to do this experiment as follows. At first I make the situation that spine size doesn t change even during glutamate uncaging using cytokarasin and catrunculin, which is inhibitor for actin polymerization. In this situation I am gonna measure the PIP3 increase or decerase. So I can observe real PIP3 change not induced by membrane insertion. 9. What is the down stream pathway of spinule formation? 10. What is the most difficult point for this work? How did you take over this problem? 11. What number of PIP3 is there in spine? Rough caluculation is 10-100 number of PIP3. How about the number and length of spinule ? raft and PIP3. my probe is subjected with palmitoyl and farnesyl modification. Recently raft proteins clustering regulate the localization of N-Ras. At least I get the response of FLIMPA3 in culture and neurons. The important proteins including PI3K is localized in raft. So PIP3 also localized in raft. But it is very interesting to discriminate the PIP3 production or reduction in raft or non-raft. 神経細胞の樹状突起には約1万個のシナプス結合があります。人が記憶する前と後で、脳の中で何かが変わっているはずです。実際、シナプスで電気の通り方などが変化することから、この一つ一つのシナプスは記憶の最小素子だと考えられています。故に、個々のシナプスの特徴を知ることは、記憶のメカニズムを探る上でとても重要です。個々のシナプスは、入力をうける神経細胞から別々に入力を受けるので、独立に働いていると考えられる一方、クロストークという減少もあります。これは、一つのシナプスに入力が起きたときに、隣接するシナプスに影響を及ぼし、隣接するシナプスで入力を受けやするするということであります。 スパインがクロストークすることはどのような意義があるのでしょうか？りんごというものを覚えたとしましょう。そのときにあるシナプスが活性化し、その付近のシナプスとクロストークします。そのときに、りんごの性質、あかい、おいしいなどの情報が近くに入力しやすくなれば、今度思い出すときに、効率がよいと考えられる。シナプス間のクロストークは、このような思考の分子レベルでのモデルとなるのではないか？と考えております。 クロストークを引き起こす因子として、従来からいろいろな因子が報告されてきました。一酸化窒素、アラキドノイルグリセロールなどの因子は、細胞膜を超えて、隣のシナプスのシナプス前膜に作用するなどの報告がありました。２００７年にラスたんぱく質が樹状突起を通って、隣のシナプスに作用することが報告されました。私は、このシナプス間のクロストークに関わる因子の一つとして、脂質シグナルがあるのではないかと考えました。脂質シグナルは、シナプス前膜からグルタミン酸が放出されるとシナプス後膜のグルタミン酸受容体が活性化し、ＰＩＰ２からホスホリパーゼＣによって、ＤＡＧ，ＰＩ３ＫによってＰＩＰ３が産生されます。ＤＡＧは、神経細胞の分化などに関わるシグナル、ＰＩＰ３は、アポトーシスに関わるシグナルを制御することが知られています。 脂質シグナルだと考える根拠は、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置すること、特にＰＩＰ３は、グルタミン酸などの刺激入力を受けた後、分解されずに数時間持続することが知られ、１秒間に０．５マイクロメートル側方拡散され、隣接するシナプスに到着することができるからです。この結果、この脂質シグナルが、隣接するシナプスに移動し、隣接するシナプスに入力を受けやすくなるのではないかと考えました。 では、どうやってこの脂質シグナルを測るかですが、従来までの脂質シグナルの測定法は、破壊分析に頼っていたために、一個一個のシナプスの個性を失っていました。そこで、生きた神経細胞で見るために、私が現在までに開発したＦＲＥＴプローブ分子を用いようと考えております。このプローブの特徴は、２つあります。１つは、脂質結合ドメインを変えることによって、様々な脂質を見ることができること。従来までに、ＤＡＧおよびＰＩＰ３のプローブを作ってきました。２つ目は膜に局在していることです。従来までに、脂質を見るためのプローブ分子として、GFPと脂質結合たんぱく質の融合プローブがよく使用されている。脂質が細胞膜で増加した際、プローブ分子が膜に移行することによって増加を確認できる。しかしながら、スパインおよび樹状突起は細胞体とつながっており、脂質プローブがスパインまたは樹状突起の膜に移動した際、細胞体にあるプローブがスパインに流れ込み、バックグランドのノイズとなる。申請者のプローブ分子は、膜に局在しているために、バックグランドがないため、スパインおよび樹状突起での脂質の動態を見るために優れている。これは、脂質シグナルをシナプスにおいて観察することができる能力を有しております。 実験においては、この作製した脂質ＦＲＥＴプローブを海馬スライスに遺伝子銃によってトランスフェクションします。次に、詳細は省きますが、自作の２光子顕微鏡を用いて、神経細胞を観察します。図のように樹状突起およびスパインが観察されます。 次に、プローブを発現した神経細胞のひとつのシナプスを刺激します。顕微鏡下で、神経細胞はこのように観察されます。２００４年にひとつのシナプスを刺激する方法が開発されました。まず、グルタミン酸前駆体をインキュベートします。一つのシナプスの近傍に光刺激を行うと、この限られた範囲でグルタミン酸が産生され、シナプスが刺激されます。これによって、脂質のシグナルがどのように起きるのかを観察します。また、図を観察すると刺激を受けたスパインだけ大きさが大きくなっていることがわかります。シナプスはある一定以上の強さの入力を受けることで、このように大きさを変えます。これは、このシナプスがこの入力を記憶したということを示しています。申請先研究室では、このシステムをいち早く取り入れ、８０％以上の確率でシナプスサイズを変えることが可能であります。 そこで、一年目では、2光子顕微鏡のセットアップを行う。それと同時に、ＰＩＰ２，ＤＡＧ，ＰＩＰ３のプローブ分子をＦＬＩＭプローブに変える。 ２年目では、一つのシナプスを刺激し、脂質シグナルがどの程度、どのくらい樹状突起まで伸びていくのかなどの、基本的な情報を得ます。時間的には、グルタミン酸産生に伴い脂質シグナルが活性化しＰＩＰ２は、基質であるために、減少し、ＤＡＧおよびＰＩＰ３は増加すると考えられます。しかしながら、ＤＡＧは破壊分析の結果から一過性、ＰＩＰ３は、持続すると期待できます。 ２年目は、脂質シグナルが届くシナプスと届かないシナプスに刺激を与え、光刺激がどの程度の刺激の強さで、スパインの大きさが変わるかを調べます。 脂質シグナルが届く範囲のスパインは、より弱い光刺激で大きくなるのではないかと期待します。 次に、脂質の移動を止めるために、セプチンたんぱく質を強制発現します。発現します。このたんぱく質は、図のようにスパインネックに発現します。緑がＧＦＰセプチン、赤は神経細胞の形状のマーカーです。セプチンは３ｎｍほどのたんぱく質でこれらがオリゴマーを形成し、スパイン脂質の移動を阻害します。この状態で、一つのシナプスを刺激します。すると脂質の移動は阻害されますから、隣接するスパインの大きさの変わり方は、遠くのシナプスと変わらないのではないかと推測できます。 この実験によって、脂質シグナルがシナプスのクロストークに必要であるかを検証します。 本研究では、 申請者が現在までに培ってきた脂質の知識 および蛍光プローブ分子を現所属研究室に導入する 現研究室にある２光子顕微鏡グルタミン酸光分解システムを用いる。 スパインにグルタミン酸刺激を与えたときに、 脂質分子のスパイン内および樹状突起上での広がりを観察する 脂質分子の移動を阻害することで、脂質シグナルが、隣接するシナプスにどのように影響を及ぼすのかを探っていく ＭＩＴ時代には何をやってきたのですか？ クロストークをとめたら連想がとまった。 脂質シグナルをとめたら連想することができなくなった。 個々のシナプスで引き起こされるシグナルは、シナプス内で留まることも予想されるが、近年、一つのスパインの変化が、隣接するスパインに影響を及ぼすことが報告されている 従来までのシナプスでのシグナル伝達を調べる方法としては、シグナル伝達の阻害剤と電気生理的手法を用いた結果が主であり、一万個存在するシナプスの総和から得られた情報である。 How much does enlargement of spine happen? How much does lipid second messenger is there? Is it right to tell lipid signaling as controller of signal? What is the function of septin? Septin is discovered in1971 in budding yeast mutants defective in cell-cycle progression. If you overexpress the septin, not only lipids but also the protein, which localize in membrane, is stopped by the septin, right? I need to prepare the septin, which have mutant ATP binding site or mutant enzyme activity delation mutant. You should learn the mechanism the pathway until producing lipid second messenger. ラフトによって、もっと上流のたんぱく質は動くことがないのではないか？ Ｇたんぱく質はそるブルだから大丈夫。しかし、Ｇｂｒは膜局在型。代謝型グルタミン酸受容体はどのＧたんぱく質を活性化するのか？また、ＰＬＣデルタ、ＰＬＣβは泳ぐが大丈夫か？ 脂質の組成がミックスしないようにたんぱく質がバリアを作っているということは結構ある。らてらるとばそらてらる。 でんどらいとにのみ発現しているようなたんぱく質はないだろうか？ What size is lipid? ゴーシュ型でC-C 1.513; C-H 1.112 Å アンチ型でC-C 1.511C-H 1.112 Å 大体DAGは5Å, 10Å PIP3は10Å, 10Å PTEN, DGKをノックアウトしたらどのくらいまで伸びるのか？ どれくらい脂質は産生するの？ 本当に脂質はシグナルの司令塔なの？ 西塚先生を出す。 デイビッドホロビンを出す。 脂質って細胞膜からどれくらい出ているのか？ＰＩＰ３だったら１５ｎｍ以上は出ていると思う。 もし、始めから脂質の移動が阻害されていたらどうする？ 確かに、CaMkIIはスパインでのみ活性化されることが知られている。 しかし、Rasは結構長く伸びることが知られている。 脂質の移動を阻害するものの有力なものとして、セプチンがあげられるのですが、エンドジーニアスなセプチンもあります。ただ、結構、すべてのスパインネックに存在しているわけではなく、もしかしたら、脂質の移動を変えるような働きをしている可能性があります。クロストークに選択性があるということでとても面白いということになります。 脂質シグナルをスパインで見ることの重要性。 何故、スパインが記憶の最小素子となるのか？ 何故あなたは脂質シグナリングを選んだのか？ 1．脂質シグナルは移動することができるシグナルの最上流である。 2．脂質シグナルの特にＰＩＰ３シグナリングはしばらくの間持続する。 ＰＫＣの局在を見てみるとデンドライトでも起きている。やっぱり脂質は移動していると考えられる。 実は、かれるによって、らすシグナルが閾値の上昇に必要だということがわかっている。しかしながら、何故ラスなのか？実は、ラスはＰＩＰ３の下流なんですよね。 PTENの局在。 DGKの局在。DGKはカルシウムによって活性化されるが、神経細胞でのカルシウムの上昇は瞬時である。 これによって、あるシグナルに反応しやすくなるようになり、ある反応に応答するシナプスクラスターができるのではないだろうか。 シナプスのクロストークに脂質シグナリングが関係していなかったら？ 脂質修飾のメカニズムについて。 ＰＩＰ２の局在は？下の論文にあるように恐らく均一に存在する。 しかし、結局のところ活性化されたグルタミン酸受容体がどこにあるかが重要でさらに、活性化したＰＩ３ＫとＰＬＣがどこにあるかによる。 Neuroscience Letters 423 (2007) 158–161 もしかするとＰＬＣやＰＩ３Ｋがデンドライトまで泳いでいって、ＰＩＰ２を代謝することはないのか？ 恐らくないと思う。その根拠は、代謝型グルタミン酸によって活性化されるＰＩ３Ｋはｐ１１０ｒだと考えられます。 このたんぱく質は、脂質修飾を受けているたんぱく質とコンプレックスを作っている。 もしかしたら他の脂質修飾されていないようなたんぱく質がＰＩＰ３を作る可能性があるかもしれないよ。 そしたら、それは、わかりません。ただ、ここで重要なのは、ＰＩＰ３ができて、それが樹状突起を移っていくことが観察できればいいのだと考えております。 ＰＩ３ｋは１，２，３型が存在する。そのうちＰＩＰ２を基質とするものは、Ｉ型だけである。一般的なＩ型のＡ型は、チロシンリン酸型受容体によって、活性化される。一方、Ｉ型のＢ型は、ｐ１１０γであり、これは、Ｇたんぱく質共役型受容体によって活性化される。Ｂｒとアダプターたんぱく質のｐ１０１と複合体を形成する。このため、かなり移動度が遅いと考えられる。よって、ＰＩＰ３のような低分子の方がかなり早く動けるのではないかと考えております。 よって、ＰＩＰ３の量は、ＰＴＥＮとＰＩ３Ｋのバランスで決まっている。しかし、 ＰＩＰ３を作り出す刺激は、グルタミン酸受容体だけなの？ いえ、恐らく他にもあるとかんがえられます。しかしながら、今回絞っているのはグルタミン酸受容体だけです。 ＤＧＫはどこにいるの？細胞質中にいますが、ＤＧＫは、９つのアイソフォームがあって、α、βは、ＰＳＤ結合ドメインを持っていないが、γ、ζはもっている。基本的に、デンドライトシナプスにいるが、後者は、ＰＳＤに濃縮されている可能性もある。 別にあなたのプローブじゃなくてもサイトゾルプローブで赤と緑比較してできるんじゃないの？ 実は、それでは難しいです。というのは、仮に、フレットプローブと膜局在プローブが培養細胞などで１００％応答した場合どちらも、最高の状態となります。しかし、神経細胞においては、デンドライトと繋がっていますから、さらに、プローブが入ってしまうわけです。すると、膜局在方はこの赤と緑がバックグランドとなって、感度が小さくなってしまうということがあげられます。よって、ＦＲＥＴプローブの方が応答はよいであろうと考えら得ます。 mGluRによって活性化されるPI3Kとして、IB型が挙げられる。これは、Ｇｂｒによって活性化される。 ちなみに、NMDA依存的にＰＩＰ２が減少する系も存在する。これには、２つの可能性が挙げられる。ＰＬＣが泳いでいった。もしくは、樹上突起にも受容体が多少なりとも存在し、それが活性化した。しかし、今調べたいのは、スパインから産生された脂質分子であるから系が全く違うと考えられる。 ＰＩＰ３は、様々な方法で産生されると考えられる。スパインにはチロシンキナーゼ受容体EPH受容体なども存在するだろう。だから、ＰＩＰ３が産生されるメカニズムはたくさんあると考えられる。しかしながら、今回はグルタミン酸受容体を考えているからそれによって活性化されるのは、代謝型グルタミン酸受容体だと考えられる。 もしかすると、ｂｒが移動するかもしれない。しかしながら、脂質とＧたんぱく質どっちが移動が早いかというと、ｇｒの方が大きいから移動しづらいと考えられる。 Rasの活性化は、11microm//4 minである。とても遅い。結局、上流のシグナルがどうなっているかについての情報は何も与えないことになる。 クロストークを行うと何がいいのか？ スパインネックが見えないんだけれどどういうこと？本当にくっついているの？ 何分後に刺激をするの？ どんな点が困難だと考えられるのか？ 逆に、スパインで制限されたらどうするの？ 答。もちろん計画を立てるときには一番面白い作業仮説をたてるわけであります。それはそれで面白いと考えられる。その一つとしてセプチンが上げられます。 普段から脂質はセプチンによって抑えられているんじゃないの？ セプチンは、細胞質のたんぱく質の拡散も防ぐんじゃないの？ それは、ＧＦＰを発現させてホトブリーチすればよい。 それを調べるためには、セプチンＲＦＰを発現させて本当にセプチンが阻害するかを調べればよい。 スパインの大きさってどれくらい？ シナプスのクロストークにプラスマイナスはあるのか？ タイトルはゴシックにする。 申請者の利点はちょっと変えるべき。 何故ＦＲＥＴを使うか？理由を述べる、 脂質シグナルをわからせる １０出たものが拡散してしまうと３になってしまう。それでよいのか？ セプチンの情報 あるセプチンは、ＰＩＰ２などとくっついて膜のbracingを起こす。Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Tanaka-Takiguchi Y, Kinoshita M, Takiguchi K. Curr Biol. 2009 Jan 27;19(2) 140-5. ＤｉＩは分裂溝を通る。 ただ、Ｄｉｌは細胞膜の表面に入ることから表側である可能性が高い。 細胞膜の成分をミックスしないで、そのまま分けるという役割を持っているたんぱく質の一つにセプチンというたんぱく質があります。セプチンは、主に細胞分裂の際に分裂溝にセプチンリングを形成し、細胞分裂に必要なたんぱく質です。また、細胞膜上の成分をミックスしないようにしているからです。 ですので、 スパインのコンパートメントについて カルシウムは、シナプスで制限される。 ＣａＭＫＩＩも同様に制限される。 しかしながら、Ｒａｓたんぱく質は制限されずに、クロストークに必要である、ただ、ラスたんぱく質は、カルシウムシグナリングによって活性化される。ＬＹ PTENの局在について 基本的に、PTEN is preferentially expressed in neurons and is especially evident in Purkinje neurons, olfactory mitral neurons, and large pyramidal neurons. To analyze the function of PTEN in neuronal differentiation シングルセルでは、核と細胞質中に存在することがわかっている。 １．神経細胞には、樹状突起上に約1万個のスパインがあります。人が記憶する前と後で、脳の中で何かが変わっているはずです。実際、このスパインは大きさをダイナミックに変えることから、一つ一つのスパインは記憶の最小単位だと考えられています。故に、個々のシナプスの特徴を知ることは、記憶のメカニズムを探る上でとても重要です。 ２．神経細胞において、脂質シグナルは、記憶のモデルとなるシナプス可塑性と呼ばれる現象に必須であります。脂質シグナルは、シナプス前膜からグルタミン酸が放出されるとシナプス後膜のグルタミン酸受容体が活性化し、ホスファチジルイノシトール４，５２リン酸、（ＰＩＰ２）から（ジアシルグリセロール）ＤＡＧ，ホスファチジルイノシトール３，４，５３リン酸（ＰＩＰ３）が産生されます。これらの脂質は、下流のたんぱく質を制御して、シナプス可塑性を引き起こします。 従来までの脂質の測定法は、破壊分析に頼っていたために、一個一個のシナプスの個性を失っていました。そこで、目的は、脂質シグナルを一つ一つのスパインで観察するということです。 ３．申請者は、現在までに、蛍光共鳴移動ＦＲＥＴプローブ分子を開発しました。CFP, YFP, 脂質結合ドメインをαへリックスで連結します。プローブを膜局在シグナルで細胞膜に連結します。脂質が増えると脂質結合ドメインが結合し、グリシングリシンを中心にプローブが動き、ＣＦＰとＹＦＰが近づきＦＲＥＴが起きます。ＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比から脂質の量を測定しました。培養細胞での脂質のそれぞれの膜での脂質の動態を明らかにしてくることによって、高い評価を得てきました。 ４本研究では、直径１μｍほどの微小空間での脂質の動態を調べることにチャレンジしてみようと考えております。直径１μｍほどの微小空間においては、現在私の用いている蛍光強度比タイプのＦＲＥＴプローブでは、ＹＦＰの光分解が激しく、蛍光強度比が一定しないという短所があります。そこで、蛍光寿命を測るためのプローブ分子に改良を行います。従来のプローブのＣＦＰをＧＦＰにＹＦＰを蛍光を発しないＹＦＰに変えます。蛍光寿命ＦＲＥＴプローブの特徴は、ＧＦＰの蛍光寿命で測定するために、ＧＦＰが光分解したとしても、ただ、蛍光強度がさがるだけで、蛍光寿命は変化しません。図のようにＦＲＥＴが起きたときは蛍光寿命を表す直線の傾きが小さくなります。よって、微小空間でも精度の高いデータを取ることが可能となります。このＦＬＩＭを導入している研究施設は、世界でも３番目、日本ではうちが始めてです。 ５．実験においては、この作製したFLIMプローブを海馬スライスに遺伝子銃によってトランスフェクションします。次に、詳細は省きますが、自作の２光子顕微鏡を用いて、神経細胞を観察します。 ６．次に、プローブを発現した神経細胞の一つ一つのシナプスを刺激します。２００４年に開発された、グルタミン酸アンケイジング法を用います。まず、グルタミン酸前駆体をインキュベートします。一つのシナプスの近傍に光刺激を行うと、この限られた範囲でグルタミン酸が産生され、シナプスが刺激されます。図を観察すると０分で刺激を受けた赤点のスパインが、大きくなっていることがわかります。シナプスはある一定以上の強さの入力を受けることで、このように大きさを変えます。これは、このシナプスがこの入力を記憶したということを示しています。申請先研究室では、このシステムをいち早く取り入れ、８０％以上の確率でシナプスサイズを変えることが可能であります。本研究では、スパインの大きさを変えた際に脂質シグナルがどのように変化するのかを追っていきます。 ７．一年目では、2光子顕微鏡のセットアップを行う。それと同時に、ＰＩＰ２，ＤＡＧ，ＰＩＰ３のプローブ分子をＦＬＩＭプローブに変える。このプローブの特徴は、脂質結合ドメインを変えることによって、様々な脂質を見ることができることです。ＤＡＧのためにＰＫＣＣ１Ｂドメイン、ＰＩＰ３のために、ＧＲＰ１のＰＨドメイン、ＰＩＰ２のためにＰＬＣデルタのＰＨドメインを結合してプローブを作製します。 ２年目では、プローブ分子を発現させます。このプローブは、スパイン、樹状突起の細胞膜に局在します。グルタミン酸産生に伴い、基質であるＰＩＰ２は減少し、ＤＡＧおよびＰＩＰ３は増加すると考えられます。しかしながら、ＤＡＧは破壊分析の結果から一過性、ＰＩＰ３は、持続すると期待できます。よって、空間的には、ＰＩＰ３が樹状突起を移動していくのではないか？と推測します。 ８．３年目は、樹状突起を進展する脂質シグナルが神経細胞の機能にどのように関わっているかを調べようと思っています。脂質シグナルは、隣接するスパインにも及ぶと考えられますから、何か、隣接するシナプスに影響を与えるのではないかと考えられシナプス間のクロストークなどを調べることがきるのではないかと考えます。例えば、近いスパインでは、遠いスパインに比べて、シナプス構造可塑性を引き起こすための、刺激の閾値が下がると期待できます。この際、樹状突起上に脂質の移動を阻害するようなたんぱく質を仕込むことで本当に脂質が関与しているかを調べようと考えております。 ９．この研究において期待できること 現在、シナプスの入力へのパターンはわかっていません。クロストークが起きれば、Ａいう入力やＢという入力に対して、あるシナプスのクラスターができると考えられます。２００７年にやっと、ラスたんぱく質のシグナリングがシナプス間のクロストークに関係することがわかるようになってきました。しかし、まだあまりにもわかっていることが少なすぎます。私の脂質の動態を明らかにすることで、脂質シグナルとシナプス間のクロストークの関係を明らかにし、記憶の基盤となる神経回路のパターンの解明を行う。 １０． ＰＩＰ３シグナリングは、１時間以上も続いているということ。これは、高頻度の電気刺激をおこなっってシナプス可塑性を誘導したときに、ＰＩＰ３産生酵素ＰＩ３Ｋの阻害剤であるＬＹ２９を加えたときに、シナプス可塑性が阻害されるということからわかります。よって、脂質の速報拡散は、０．５μｍ・秒なので、十分に樹状突起を移動することができるということ。ラスたんぱく質のシグナルが樹状突起を介して隣のシナプスに移動し、スパインのシナプス可塑性の閾値を下げるということは報告されています。もちろん、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置しているわけですから、脂質シグナルがどのようにラスたんぱく質を制御しているかを調べることは興味深いと考えられます。 もう少し、クロストークの背景を教えてください。 ＮＯやエンカンナビノイドなどについても含めて。 ＮＯやエンカンナビノイドのクロストークは、ＮＯやエンカンナビノイドが膜を超えることができて、これがシナプス前膜に作用して、隣接するシナプスへ影響を与えるというものであります。しかし、これらの研究は、専ら、電気生理学で行われており、本当に、隣接するスパインでのクロストークを見ているかについては全く、わかっておりません。 このように、シナプス前膜に作用するわけですが、シナプスのクロストークは何も前膜だけでなくて、シナプス後膜スパインで起きていてもよいわけです。近年、２００８年にすぼぼだ博士が始めてＲａｓシグナルが関与しているということを示しました。興味深いことにラスと脂質シグナルは結びついている。よって、脂質シグナルも何か関係があるのではないかと期待しております。 一つのスパインを調べることそんなに必要なの？ 大事です。そもそも脳を研究する究極の目的は、脳を完全に理解することです。理解することができれば、それをターゲットとした薬も作ることができる。しかし、現在、記憶を担う記憶の回路については、ほとんどブラックボックスなのです。いきなり難しいことはできない。記憶の最小単位のシナプスがどのような回路パターンで振舞っているのかを調べることができれば、次の高次構造を調べることができる。さらに、神経細胞レベルで調べることができれば、もっと、神経同士のクロストークを調べることができます。だから、スパインでのいろいろな角度からの情報がほしいのです。だから調べることは意義があります。 クラスター化することってそんなに大事なの？ これから調べるのでなんとも言えませんが、大事だと考えられます。 これは、ちょっと、大胆な仮説でありますが、例えばりんごという情報を記憶したとする。その時、周りのスパインにも影響を及ぼします。これによって、りんごに付随する情報、赤い、おいしいなどのものを近傍に入力しやすくします。すると、今度思い出すとき、神経回路にとって効率よく思い出すことができる。そのようなことを念頭に考えております。 このためには、例えば、これに脂質シグナルが関与するかを調べるためには、脂質シグナルを樹状突起上で阻害するような、マウスを作ってやって行動解析を行うことによって何か情報が得られるのではないか？もし、この実験でうまくいけば、そのようなことも可能だと考えられます。 カレルのパクリじゃないの？ Ｒａｓシグナリングは、１０マイクロメートル。ねいちゃーのやつも１０マイクロメートル。 病気と脂質シグナルの関係は？ 最近、報告された例は、２００８年にアルツハイマー病に関与するＡｂたんぱく質を皮質一時神経細胞に加えるとＰＩＰ２の量を減らすことが報告された。これは、カルシウム依存的で、しなぷとじゃにんを発現していないラットでは、ＰＩＰ２の起きないことがわかっている。よって、Ａｂの影響は、しなぷとじゃにんを介してＰＩＰ２を減らすことで神経細胞の不全を起こしているのではないか？と考えています。ダウンシンドロームのモデルマウスでＰＩＰ２の量が減っているということも知られております。また、加齢マウスでは、ＰＩＰ２の量が減っていることが知られて、ＰＩＰ２の原料となる脂肪酸を加えるとＰＩＰ２が増えてさらにシナプス可塑性があがることが知られています。また、PIP3シグナルの下流のGSKたんぱく質が、加齢における記憶の再固定に関わっていることが、ノックアウトマウスを使った実験から明らかになっている。 ＦＬＩＭに最低限必要なこととは？ １．８０ＭＨｚのパルスレーザー ２．高感度の光電子増倍管 ３．ナノ秒オーダーで蛍光寿命を取得するハードウェア 蛍光寿命についてもう少し詳しく教えてください。 蛍光体が励起光を受けると励起状態になります。ここでの滞在時間が蛍光寿命です。励起光が基の準位に戻るときには、３つの過程でもどります。発光遷移（光）、無放射遷移（熱）、蛍光共鳴エネルギー移動です。ここにあくせぷたーがあると、Ｓ１状態での蛍光体の滞在時間が短くなる。よって、蛍光寿命を表す減衰曲線が短くなります。 やることたくさんあるけれど、現実可能なのか？ やるべきことの重要なポイントとしては。 １．２光子顕微鏡のセットアップ。およびグルタミン酸アンケイジングシステム。これは、ＭＩＴ時代に習いましたので、単純に組み立てるだけです。 ２．ＦＬＩＭのセットアップ。これも、脂質プローブではありませんが、すでに、ＦＬＩＭを取るためのノウハウはありますので、あとは、組み立てるだけです。 ３．プローブ作りおよびその改良は、１年目で行えます。 ４．一度、このようにＦＬＩＭが取れる設備が完了すれば、後は、とるだけですのでどのように研究を進めるかというアイディア勝負になると思います。ですので、多くは見えますが、１年あればセットアップはできます。 俺は、こうじゃなくてもいいんじゃない？という質問に弱い。 あと、今まで、考えたことがないようなことを聞かれると弱い。 だけど、これに関しては誰でも一緒。 次に、脂質の移動を止めるために、セプチンたんぱく質を強制発現します。発現します。このたんぱく質は、図のようにスパインネックに発現します。緑がＧＦＰセプチン、赤は神経細胞の形状のマーカーです。セプチンは３ｎｍほどのたんぱく質でこれらがオリゴマーを形成し、スパイン脂質の移動を阻害します。この状態で、一つのシナプスを刺激します。すると脂質の移動は阻害されますから、隣接するスパインの大きさの変わり方は、遠くのシナプスと変わらないのではないかと推測できます。 この実験によって、脂質シグナルがシナプスのクロストークに必要であるかを検証します。 ジーンがんの効率 これは、ばいおらっどとも話したのですが、まず、金粒子が入る確率および発現効率とも調べてないからわかっていないようです。そして、金が入ることによって、死んでしまう細胞も中にはあるかもしれないです。うまい具合に入ったものだけが光る。選択性は多少あります。しかし、この理由はわかりません。入った細胞だけが変なんじゃないの？その可能性は１００％否定できるわけではありません。しかし、２つあって、一つは、われわれの用いているシナプス構造可塑性に関しては、問題がないこと。また、他の研究者もこれ以外に遺伝子を導入する方法はなく、これを使っていること。入った細胞だけ大きさが変わっているんじゃないの？実はというと、電顕でアンケイジングしたスパインを見たものがあります。やはり変わっていました。 それって、ＭＩＴでやったことでしょ？そういうの出しちゃだめだよ。 ２光子顕微鏡のメリットは？共焦点との違いは？ 励起光が違う。 中まで到達することができる。紫外光による細胞ダメージはない。 ただ、スライスの表面などでは、共焦点でも細胞体は見ることが可能である。 ただ、ゆくゆくはねずみの頭などで行うには、共焦点では明らかに見えません。この理由は赤外光だから ２光子顕微鏡の分解能は、共焦点と同じくらいで200-300 nmくらい？ しかし、ｚ軸分解能はとても悪くなる。 また、実際には、うちのシステムは、共焦点ではできません。というのは、あんけいじんぐは、光分解を一点で行う必要があります。共焦点では、できない。 脂質とプローブの関係はどうなっているのか？ 普通培養細胞は、１ｐｌくらいだと考えられています。 スパインの中は０．１ｆｌから０．０１ｆｌくらい 大体、１００倍くらいだと考えられます。 大体、ＤＡＧは、１ｆモルです。一細胞に。 だから、１０あぷとモルくらいある。 ＰＩＰ３の場合は、その１００倍くらい少ないから。１００ゼプト盛るくらいあります。これが、刺激によって１０倍くらいに変わるといわれています。 脂質プローブと脂質の結合能は、かなり高いですから、始めから結合していると考えられます。ここで、刺激が加わると、破壊分析の結果などを参考にしますと１０倍から最大で５０倍くらいの脂質ができます。これに、プローブが反応して応答するということになります。これは、プローブ全部を応答させるための量く らいできます。 ＦＬＩＭについてもう少し教えて？ ＦＬＩＭのメリットは？他にないの？ 蛍光強度比フレットだと、ＹＦＰのスペクトルが漏れて、ＹＦＰも励起してしまう。あと、ＹＦＰの蛍光のＣＦＰへの漏れこみも問題になってくる。 しかし、ＦＬＩＭでは、ＹＦＰが消えているので問題ない。 現在は、場所をきちんと記憶できるようなステージがあるので、これを用いてシナプスの場所を特定して、アンケイジングを行って免疫染色を行うというのは不可能なのか？ 答え。ポイントは、リアルタイムでとることができないということになるでしょう。２番目には、刺激前と後で比較を行うことができないということです。 あなたのプローブ本当にそのように働いているの？ 例えば、グリシングリシンを除くとうまく働かなくなる。また、脂質局在ドメインを除いた細胞質プローブではうまくいかないなどの点から、確かに、このプローブのポイントとなるところがきちんと働いて脂質を検出していると考えられます。 現在、FLIMを行っている人の研究者はどれくらいいるの？ 神経細胞ということで、ＦＬＩＭの論文を出しているというところになると、３人ほど思い出します。一人目はハーバードのＭＧＨで、アルツハイマー病のマウスやラットにおいて、カルシウムシグナルがどのように変化しているかを調べているぶらいあんばくすかい博士。しかし、この研究はシナプスではなく主に細胞体で調べております。次に、スパインレベルであると、かなり少なくて、かれるすぽぽだと、やすだりょうへい博士です。やすだ博士はかれるのぽすどくでした。近年、ＭＩＴ時に林研で作製したＣａＭｋＩＩプローブをＦＬＩＭに改良してＣａＭｋＩＩの活性を調べて高い評価を受けたことは記憶に新しいです。 脂質の動態ということになると、培養細胞レベルでは、京都の松田先生が、私たちのプローブを用いて脂質の動態を観察しております。斉藤尚明先生がＰＫＣの活性化を調べております。 Ｒｏバリューはどれくらい。５０から６０Åくらい。 ２光子と共焦点の違い 実際、共焦点でもスライスくらいだったら神経細胞体のカルシウムイメージングなどは可能である。 今まで、細胞質タイプのプローブで見られていると思うけれどあれじゃだめなの？ はい、まず大前提にあるのは、細胞質タイプのプローブで調べられているのは、神経細胞全体を刺激しているということ。そうすると、全体が刺激されるので、プローブの局在をみることができます。しかしながら、一点でグルタミン酸刺激を行うと、細胞質タイプでは見ることができません。何故かと言うとポイントは、バックグラウンドです。 どのくらいの長さイメージングするの？シナプス構造可塑性の実験では、大体一時間くらい。ですので、一時間くらい観察しようと考えております。 プローブの局在はどうなるの？私のプローブ分子には、Ｎ－ｒａｓの脂質修飾ドメインがついております。スパインおよび樹状突起です。 メカニズムは？ファルネシル基で小胞体に結合し、パルミトイル基で細胞膜に結合します。 昔の研究のぽいんとは？ 私のプローブ分子の特徴は、２点あります。 それによって、図で示す。 透明ＹＦＰの原理？ 蛍光は、蛍光体が高い順位から低い順位に移るときに起きます。 その際に、発光遷移のほかに、２つ影響を受けるものがあります。 一つは、無放射遷移、これは、熱によるもの。 ２つめは、蛍光共鳴エネルギー移動。 透明なＹＦＰの場合は、この無放射遷移で起きています。 この研究で困難だと思われるところはどこでしょうか？ カルシウムシグナリングとの関係は？ カルシウムによって、ＣａＭＫＩＩなどが活性化しシナプス可塑性を誘導します。阻害剤を加えた実験から、カルシウムシグナリングも脂質シグナルもどちらも、シナプス可塑性に重要であることがわかっています。しかしながら、カルシウムシグナリングは、スパインで留まることが知られています。よって、シナプスのクロストークはむしろ代謝型グルタミン酸受容体が関与しているのではないかと考えております。しかしながら、グルタミン酸受容体の下流の脂質シグナルは、カルシウムシグナリングに比べてほとんどわかっておりません。よって、調べるために意義のあることだと考えます。 岡本さんのＦＲＥＴの図と安田さんの図 これすべて、すでにできているんじゃない？ 簡単にできるんじゃないの？ 確かに、２光子顕微鏡のセットアップ、アンケイジングシステムのセットアップ、ＦＬＩＭの測定のノウハウは知っていますが、実際組み立てるのはかなり時間がかかります。あっという間に１年かかります。逆に言うとそれくらいじゃないと３年間では終わりません。 他に、どんなＦＲＥＴプローブを作ったら面白いの？ ＦＬＩＭは本当に高感度か？ シナプス可塑性ってどうやって測るの？ ＭＩＴ時代には何をやってきたのですか？ 大きく分けて３つあります。２行使顕微鏡のセットアップのノウハウ。アンケイジング法のノウハウ。ＦＬＩＭの測定のノウハウ。実際、私、昔脂質の研究を行っていまして、脳という新しい分野に挑戦するに当たって、脳のことほとんど知らなかったので、しかも、初めての海外ということで言葉は通じないし、林先生に朝から晩まで働かされるし、本当に大変でした。 ＦＬＩＭとかだしちゃっておかしくない？書いてないよ？ ２点ありまして、１点目は、申請書に書ききれなかったということ。 ２点目は、私は、常に面白いアイディアを考えております。よって、面白いものがあれば、どんどんアップデートをしていきます。 何か、脂質シグナルがシナプスのクロストークに関係しているという証拠はあるの？ 確定的な証拠はありません。間接的な証拠としましては、ＰＩＰ３シグナリングは、１時間以上も続いているということ。これは、高頻度の電気刺激をおこなっってシナプス可塑性を誘導したときに、ＰＩＰ３産生酵素ＰＩ３Ｋの阻害剤であるＬＹ２９を加えたときに、シナプス可塑性が阻害されるということからわかります。よって、脂質の速報拡散は、０．５μｍ・秒なので、十分に樹状突起を移動することができるということ。ラスたんぱく質のシグナルが樹状突起を介して隣のシナプスに移動し、スパインのシナプス可塑性の閾値を下げるということは報告されています。もちろん、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置しているわけですから、脂質シグナルがどのようにラスたんぱく質を制御しているかを調べることは興味深いと考えられます。 では、他に何か面白いテーマはないの？ 確かに、ＰＩＰ２は、シナプス前膜で調べられているので、ベシクル小胞が放出する際に、このプローブをシナプス前膜に導入しておいてどのような時に産生しているのかということを調べることは重要です。それよりも、私が興味を持っているところは、シナプス構造可塑性、つまり、シナプスが大きくなるときに、劇的に脂質の量が増えているわけです。短期間でのこの脂質の増加は、ちょっと信じられません。例えば、細胞分裂は５時間ほどをかけて１つが２つになるわけですが、この可塑性に関しては、１分以内に２倍以上になるわけです。この時、とんでもなく脂質代謝が動いていると想像できます。そのパスは２つあって、１つは、細胞膜で激しく脂質産生酵素が動いていること。もう一つは、トランスゴルジなどから激しく膜輸送が起きること。どちらかを調べることはとても面白いと考えております。 私は、常に、よくなるように考えております。ですので実験がよいと思えば変えます。本筋は外れておりません。 従来までのグルタミン酸を放出する方法。 バスアプリケーション。マイクロパフ。電気刺激 刺激はどのようにやっているの？ ０．５Ｈｚ．２ｍｓ、１Ｈｚなど。とにかく電気生理でシナプス可塑性が起きていれば大丈夫。 クロストークをとめたら連想がとまった。 脂質シグナルをとめたら連想することができなくなった。 How much does enlargement of spine happen? How much does lipid second messenger is there? Is it right to tell lipid signaling as controller of signal? What is the function of septin? Septin is discovered in1971 in budding yeast mutants defective in cell-cycle progression. If you overexpress the septin, not only lipids but also the protein, which localize in membrane, is stopped by the septin, right? I need to prepare the septin, which have mutant ATP binding site or mutant enzyme activity delation mutant. You should learn the mechanism the pathway until producing lipid second messenger. ラフトによって、もっと上流のたんぱく質は動くことがないのではないか？ Ｇたんぱく質はそるブルだから大丈夫。しかし、Ｇｂｒは膜局在型。代謝型グルタミン酸受容体はどのＧたんぱく質を活性化するのか？また、ＰＬＣデルタ、ＰＬＣβは泳ぐが大丈夫か？ ラフトとＰＩＰ３の関係は？ 確かに、ラフトみたいなところでできますが、物理的な面から言うと、ラフトは、比較的飽和脂肪酸を足に持った脂質がいるところです。ＰＩＰ３，ＤＡＧの足は、ステロイルアラキドノイルなので、ラフトをでることはあながちおかしくないと考えられます。 脂質の組成がミックスしないようにたんぱく質がバリアを作っているということは結構ある。らてらるとばそらてらる。 でんどらいとにのみ発現しているようなたんぱく質はないだろうか？ What size is lipid? ゴーシュ型でC-C 1.513; C-H 1.112 Å アンチ型でC-C 1.511C-H 1.112 Å 大体DAGは5Å, 10Å PIP3は10Å, 10Å PTEN, DGKをノックアウトしたらどのくらいまで伸びるのか？ 本当に脂質はシグナルの司令塔なの？ 西塚先生を出す。 デイビッドホロビンを出す。 脂質って細胞膜からどれくらい出ているのか？ＰＩＰ３だったら１５ｎｍ以上は出ていると思う。 もし、始めから脂質の移動が阻害されていたらどうする？ 確かに、CaMkIIはスパインでのみ活性化されることが知られている。 しかし、Rasは結構長く伸びることが知られている。 脂質の移動を阻害するものの有力なものとして、セプチンがあげられるのですが、エンドジーニアスなセプチンもあります。ただ、結構、すべてのスパインネックに存在しているわけではなく、もしかしたら、脂質の移動を変えるような働きをしている可能性があります。クロストークに選択性があるということでとても面白いということになります。 脂質シグナルをスパインで見ることの重要性。 ２光子顕微鏡のメリットとは？ 共焦点でも、スライスでも見えるんじゃないの？ 別に、２光子顕微鏡で見なくてもいいんじゃないの？ 何故あなたは脂質シグナリングを選んだのか？ 1．脂質シグナルは移動することができるシグナルの最上流である。 2．脂質シグナルの特にＰＩＰ３シグナリングはしばらくの間持続する。 ＰＫＣの局在を見てみるとデンドライトでも起きている。やっぱり脂質は移動していると考えられる。 実は、かれるによって、らすシグナルが閾値の上昇に必要だということがわかっている。しかしながら、何故ラスなのか？実は、ラスはＰＩＰ３の下流なんですよね。 PTENの局在。 DGKの局在。DGKはカルシウムによって活性化されるが、神経細胞でのカルシウムの上昇は瞬時である。 これによって、あるシグナルに反応しやすくなるようになり、ある反応に応答するシナプスクラスターができるのではないだろうか。 シナプスのクロストークに脂質シグナリングが関係していなかったら？ 脂質修飾のメカニズムについて。 ＰＩＰ２の局在は？下の論文にあるように恐らく均一に存在する。 しかし、結局のところ活性化されたグルタミン酸受容体がどこにあるかが重要でさらに、活性化したＰＩ３ＫとＰＬＣがどこにあるかによる。 Neuroscience Letters 423 (2007) 158–161 もしかするとＰＬＣやＰＩ３Ｋがデンドライトまで泳いでいって、ＰＩＰ２を代謝することはないのか？ 恐らくないと思う。その根拠は、代謝型グルタミン酸によって活性化されるＰＩ３Ｋはｐ１１０ｒだと考えられます。 このたんぱく質は、脂質修飾を受けているたんぱく質とコンプレックスを作っている。 もしかしたら他の脂質修飾されていないようなたんぱく質がＰＩＰ３を作る可能性があるかもしれないよ。 そしたら、それは、わかりません。ただ、ここで重要なのは、ＰＩＰ３ができて、それが樹状突起を移っていくことが観察できればいいのだと考えております。 ＰＩ３ｋは１，２，３型が存在する。そのうちＰＩＰ２を基質とするものは、Ｉ型だけである。一般的なＩ型のＡ型は、チロシンリン酸型受容体によって、活性化される。一方、Ｉ型のＢ型は、ｐ１１０γであり、これは、Ｇたんぱく質共役型受容体によって活性化される。Ｂｒとアダプターたんぱく質のｐ１０１と複合体を形成する。このため、かなり移動度が遅いと考えられる。よって、ＰＩＰ３のような低分子の方がかなり早く動けるのではないかと考えております。 よって、ＰＩＰ３の量は、ＰＴＥＮとＰＩ３Ｋのバランスで決まっている。しかし、 ＰＩＰ３を作り出す刺激は、グルタミン酸受容体だけなの？ いえ、恐らく他にもあるとかんがえられます。しかしながら、今回絞っているのはグルタミン酸受容体だけです。 ＤＧＫはどこにいるの？細胞質中にいますが、ＤＧＫは、９つのアイソフォームがあって、α、βは、ＰＳＤ結合ドメインを持っていないが、γ、ζはもっている。基本的に、デンドライトシナプスにいるが、後者は、ＰＳＤに濃縮されている可能性もある。 別にあなたのプローブじゃなくてもサイトゾルプローブで赤と緑比較してできるんじゃないの？ 実は、それでは難しいです。というのは、仮に、フレットプローブと膜局在プローブが培養細胞などで１００％応答した場合どちらも、最高の状態となります。しかし、神経細胞においては、デンドライトと繋がっていますから、さらに、プローブが入ってしまうわけです。すると、膜局在方はこの赤と緑がバックグランドとなって、感度が小さくなってしまうということがあげられます。よって、ＦＲＥＴプローブの方が応答はよいであろうと考えら得ます。 mGluRによって活性化されるPI3Kとして、IB型が挙げられる。これは、Ｇｂｒによって活性化される。 ちなみに、NMDA依存的にＰＩＰ２が減少する系も存在する。これには、２つの可能性が挙げられる。ＰＬＣが泳いでいった。もしくは、樹上突起にも受容体が多少なりとも存在し、それが活性化した。しかし、今調べたいのは、スパインから産生された脂質分子であるから系が全く違うと考えられる。 ＰＩＰ３は、様々な方法で産生されると考えられる。スパインにはチロシンキナーゼ受容体EPH受容体なども存在するだろう。だから、ＰＩＰ３が産生されるメカニズムはたくさんあると考えられる。しかしながら、今回はグルタミン酸受容体を考えているからそれによって活性化されるのは、代謝型グルタミン酸受容体だと考えられる。 もしかすると、ｂｒが移動するかもしれない。しかしながら、脂質とＧたんぱく質どっちが移動が早いかというと、ｇｒの方が大きいから移動しづらいと考えられる。 Rasの活性化は、11microm//4 minである。とても遅い。結局、上流のシグナルがどうなっているかについての情報は何も与えないことになる。 クロストークを行うと何がいいのか？ スパインネックが見えないんだけれどどういうこと？本当にくっついているの？ 何分後に刺激をするの？ どんな点が困難だと考えられるのか？ 逆に、スパインで制限されたらどうするの？ 答。もちろん計画を立てるときには一番面白い作業仮説をたてるわけであります。それはそれで面白いと考えられる。その一つとしてセプチンが上げられます。 普段から脂質はセプチンによって抑えられているんじゃないの？ セプチンは、細胞質のたんぱく質の拡散も防ぐんじゃないの？ それは、ＧＦＰを発現させてホトブリーチすればよい。 それを調べるためには、セプチンＲＦＰを発現させて本当にセプチンが阻害するかを調べればよい。 スパインの大きさってどれくらい？ シナプスのクロストークにプラスマイナスはあるのか？ タイトルはゴシックにする。 申請者の利点はちょっと変えるべき。 何故ＦＲＥＴを使うか？理由を述べる、 脂質シグナルをわからせる １０出たものが拡散してしまうと３になってしまう。それでよいのか？ セプチンの情報 あるセプチンは、ＰＩＰ２などとくっついて膜のbracingを起こす。Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Tanaka-Takiguchi Y, Kinoshita M, Takiguchi K. Curr Biol. 2009 Jan 27;19(2) 140-5. ＤｉＩは分裂溝を通る。 ただ、Ｄｉｌは細胞膜の表面に入ることから表側である可能性が高い。 細胞膜の成分をミックスしないで、そのまま分けるという役割を持っているたんぱく質の一つにセプチンというたんぱく質があります。セプチンは、主に細胞分裂の際に分裂溝にセプチンリングを形成し、細胞分裂に必要なたんぱく質です。また、細胞膜上の成分をミックスしないようにしているからです。 ですので、 スパインのコンパートメントについて カルシウムは、シナプスで制限される。 ＣａＭＫＩＩも同様に制限される。 しかしながら、Ｒａｓたんぱく質は制限されずに、クロストークに必要である、ただ、ラスたんぱく質は、カルシウムシグナリングによって活性化される。ＬＹ PTENの局在について 基本的に、PTEN is preferentially expressed in neurons and is especially evident in Purkinje neurons, olfactory mitral neurons, and large pyramidal neurons. To analyze the function of PTEN in neuronal differentiation シングルセルでは、核と細胞質中に存在することがわかっている。 一人目の先生が、免疫染色でＰＩＰ３の進展は確認されているの？という質問をしてきた。俺は、前に佐々木とそのことについて話していたにも関わらず、うまく説明することができなかった。結局、リアルタイムで取れることが大事だという風に言ってしまったが、そうじゃない。本当の答えは、シナプス構造可塑性を起こしたスパインを、一度視野からはずして、免疫染色して見るというのは極めて不可能に近いということである。そのように答えないと正解とはいえない。今考えてみると、ちょっと、彼も不思議そうな顔をしていた。
https://w.atwiki.jp/towerunitejp/pages/141.html
Happy Holidays 2023 開催期間（2023 12/16 ～ 2024 ??/??） イベント概要 ミニゴルフなどのゲームや、PLAZAミニゲームを遊ぶことでホリデーコインが手に入る、ホリデーコインを使ってホリデーアイテムを交換しよう。 今年からホリデーイベントに困ったNPCを助けるクエストが追加されました！クエストを1つ進めるごとにホリデーコインが1つ手に入り、完了するとホリデー限定実績が入手できるのでぜひクエストを完了しましょう。 他にもPLAZAがクリスマス仕様に飾り付けられる他、クリスマス限定ミニゲームやPLAZA中央の噴水近くにホリデーコインショップがオープンしています。 また、期間中はPLAZA内のどこかに、ホリデーイベントキャラクターが出現して、話しかけると限定アイテムを獲得できます。 また、ホリデープレゼントイベントではプラザ中に落ちているプレゼントボックスを集めることで様々なアイテムを獲得できます。 ※コインの出現条件は6分に一度ユニットなどを取得したとき。(アーケードも対象) NEW ホリデープレゼントイベント！ （画像） イベント期間中の特定の時間にPLAZAのあちこちにプレゼントボックスが出現します！ プレゼントボックスを拾うと手にもてるお菓子や少量のunitを手に入れることができます。 プレゼントボックスを拾い集めて様々なアイテムを手に入れましょう！ イベントの開催は30秒前に全体チャットで告知されます。 また、残りのプレゼントボックスの数はTABキーを押して出るプレイヤー一覧の最下部に表示されます。 獲得できるアイテム 消えたトナカイ 中央噴水エリアにいる赤鼻のトナカイに話しかけるとイベントスタート。 行方不明になっている彼の仲間のトナカイを探してあげよう！ トナカイを1体見つけるごとにホリデーコインを1枚、無事すべてのトナカイを見つけるとホリデー限定実績である『The Case of the Missing Reindeer』が入手できます。 大まかな位置に〇をつけたヒント地図 https //img.atwiki.jp/towerunitejp/attach/141/1371/2023tonakaimap.jpg 帽子が無い雪だるま 中央噴水エリアにいる雪だるまに話しかけるとイベントスタート。 プラザの様々なところにいる帽子の無い雪だるまに帽子をかぶせてあげましょう！ 雪だるまに帽子を1つ渡すごとにホリデーコインを1枚、無事すべての雪だるまに帽子を渡すとホリデー限定実績である『You Have Snow Friends』が入手できます。 大まかな位置に〇をつけたヒント地図 https //img.atwiki.jp/towerunitejp/attach/141/1372/2023yukidarumamap.jpg サンタさんのお手伝い 中央噴水エリアにいるサンタカニ(ショップの隣にいる小さいほう)に話しかけるとクエストスタート サンタカニからもらえるヒントをもとにプレゼントを渡す相手を探しましょう！ プレゼントを渡す相手はショップNPCだけなので場所はかぎられるのですが、ヒントはかなり抽象的でTower Uniteに詳しい人でも苦戦することは間違いないでしょう。 プレゼントを1つ渡すごとにホリデーコインを1枚、無事すべてのプレゼントを渡すとホリデー限定実績である『The Little Delivery That Could』が入手できます。 プレゼントを渡す相手のヒントと貰った相手のリアクションを翻訳したページはこちらから holiday_present + 渡す順番の答えはこちら パーティー用品店(CELEBRATiONS) DIYショップ ネコのマジックショップ(灯台) ボーリング場(ピン人間) ボーリング場(普通の人間) ロブスインポート 海の家 釣具屋 家具屋 おもちゃ屋 家電屋 arcade project12のバーテンダー(ビル屋上) 食料品店 植木屋の鳥 ピザ屋 服屋 アイスクリームショップ カラオケ シーダラーショップ 不動産屋 ホットドッグ売りの犬 映画館の店員 プライベートシアター 音楽機材店 自販機(タイピングダービーの前) ハッピーホリデー！ （画像） イベント期間中に、ランダムでPLAZAのどこかに出現するイベントキャラクターに話しかけてアイテムを獲得しよう！ キャラクターの訪問は、直前に全体チャットで予告される他、キャラクターが出現している間はTABキーを押して表示されるプレイヤー一覧の最下部に「Holiday CHARACTER VISIT」と表示されます。 出現するキャラクター クッキー＆ミルク 凍ったナイト カニのサンタ 目玉のあるクリスマスツリー 獲得できるアイテム（詳細はイベント限定アイテムへ） ホリデーコイン ホリデーミニゲーム minigame経験値は入手したユニット×2 スノーボールバトル （画像） 特別イベントエリアに入って雪合戦をするミニゲーム。 SDNLのMeadownｓが雪景色に変わったマップで雪合戦をする、雪玉は放物線を描いて飛ぶ上にプラザの負荷の関係でラグが強くでる場合が多いので、狙って投げるより数を投げることを心掛けたい。 スペシャルウェポンが出る場所には雪玉ランチャーがでるので取るとかなり有利になるが当然狙われやすいので気を付けよう。 PvPゲームなので相手がいないと成立しないのは注意。 報酬はスコアに応じたUnits（1Score=1Units） ジンジャーブレッドスマッシュ （画像） ミニゲームエリアに出現するジンジャーブレッドを、キャンディーケインで叩いて砕くミニゲーム。 基本1shot10ポイントで、連続で当てた数によって、スコアの倍率が増えるので（最大×６）できるだけ沸きのペースに合わせて叩いていきたい。 報酬はスコアに応じたUnits（1Score=1Units）
https://w.atwiki.jp/boyfriendkari/pages/2517.html
生徒名簿 ＞ 東雲巽 ＞［HAPPY FLOWER］東雲巽(SR) ※ボイスやアピールボイス、ストーリーはありません。また、アルバイトやデート、進展もできません。 [HAPPY FLOWER]東雲巽(SR) 攻魅力 3641 守魅力 3498 攻Ｍ 21939 守Ｍ 21075 コスト 17 卒業祝い 20000メン アピール 誕生日だからな、勝利で飾らせてもらう。 └Knightタイプの攻守魅力大UP ストーリー なし 入手方法 台詞 マイページ +... おまえが祝いに来てくれてうれしいぞ。 綺麗な花束だ……見てるだけで癒される。 プレゼント、いつまでも大事にするからな。 登校 +... 朝 ああ、[名前]。おまえの顔が見たかったんだ。会えてうれしいぞ。 いい朝だと感じるのは、こうしておまえに会えたからだな。 俺の誕生日を祝いたい？ うれしいことを言ってくれるんだな。 放課後 俺もおまえの誕生日を祝ってやりたい。今から楽しみだ。 クラスの連中がプレゼントをくれてな、どれもいい物だったぞ。 [名前]、また会えたな。おまえとなら、何度でも会いたいと思う。 夜 おまえにバースデーソングを歌ってほしい……ははっ冗談だ。 今日はまだおまえを帰したくない……なんて我儘すぎるか？ 誕生日ってのはいいな……祝ってもらえて心が温かくなった。 カレ自慢 +... 対決画面 ― 大事な女のためだ……勝負は受ける。 告白タイム +... [部分編集] 戦闘中台詞 ― 勝利 ― 敗北 ―
https://w.atwiki.jp/boyfriendkari/pages/2515.html
生徒名簿 ＞ 北城猛 ＞［HAPPY FLOWER］北城猛(SR) ※ボイスやアピールボイス、ストーリーはありません。また、アルバイトやデート、進展もできません。 [HAPPY FLOWER]北城猛(SR) 攻魅力 3641 守魅力 3498 攻Ｍ 21939 守Ｍ 21075 コスト 17 卒業祝い 20000メン アピール 誰が来ようと今日は負ける気がしねぇ！ └Knightタイプの攻守魅力大UP ストーリー なし 入手方法 台詞 マイページ +... あークソ。堅っ苦しい格好は性に合わねぇ。 その、なんだ。祝ってくれて、ありがとな。 ま、こういう誕生日も悪かねぇ……かもな。 登校 +... 朝 誕生日？ べ、別にわざわざ祝うほどのイベントでもねぇだろ。 日付が変わったら誕生日のログボチェック。んなもん基本だろ。 人から祝われるってのは、なんか背中がむず痒くなるな。ウゼェ。 放課後 ゲーセンにも誕生日特典があるとこもあるぞ。行くしかねぇよな。 ったく、俺の誕生日を祝おうなんて、物好きにもほどがあんだろ。 暇なら放課後、付き合え。退屈しねぇとこに連れてってやるよ。 夜 借りは作らねぇ主義だ。誕生日は空けとけ。……なんかしてやる。 ギルドの連中、俺の誕生日を祝う気かよ。ま、付き合ってやるか。 誕生日を祝ってくれた礼は、一応その、後でメールで伝える……。 カレ自慢 +... 対決画面 ― 主役はテメェじゃねぇ。引っ込んでろ。 告白タイム +... [部分編集] 対決画面 ― 勝利 ― 敗北 ―
https://w.atwiki.jp/iwannabethewiki/pages/4845.html
製作者 魚の女性 DL先↓ http //www.mediafire.com/file/43oc8j5845jflh6/I+wanna+Happy+the+Birthday+Casualcrap.zip
https://w.atwiki.jp/happyhappyhappyhappy/pages/53.html
9th/Feb/2012 12th/Feb/2012 What I need to think about is 1. Discussion day--Monday and Thursday 2. Whole view like when do we finish and what journal will we publish 3. Backgrond she did 4. what techiniques she has 5. Study of cofilin, two photon microscopy, laser principle and PIP2 6. To prepare paper.
https://w.atwiki.jp/magichappy/pages/165.html
▼ セルビナ Naillina セルビナ町長官邸にようこそ。 何のご用でしょうか？ 選択肢：何を聞こうか？ この町の施設について Naillina では、説明いたします。 この町には漁師ギルド売店、 織工ギルド売店、宿屋、船会社があります。 Naillina また、その他にも 武器屋のトラピオン(Torapiont)が宿屋に、 道具屋のドージュマ(Dohdjuma)が 倉庫の前にいます。 この町について Naillina この町の 何についてのご説明が必要ですか？ 選択肢：何について聞こうか？ 歴史 Naillina では、説明いたします。 セルビナは元々、グスタベルク地方で 産出する鉱石を積み出すために、 バストゥークによって建設された港町でした。 Naillina その後、貿易港として栄え、 先の大戦が勃発したときに中立を宣言、 独立した自治都市として今日に至っています。 地理 Naillina では、説明いたします。 セルビナはクォン大陸の中部、 バルクルム砂丘に位置します。 Naillina 砂丘と浅瀬が広がる中、 港を開くのに適した唯一の場所に この町が建設されました。 産業 Naillina では、説明いたします。 元々、鉱石の積出港として始まったセルビナは、 港を中心とした貿易によって繁栄してきました。 Naillina しかし、輸送の要が 近年就航した飛空艇に移りつつある昨今、 セルビナは漁業や牧畜といった地場産業に 力を入れるようになってきています。 もういい/何も聞くことはない Naillina わかりました。 何かご質問がございましたら、 町長官邸までお越しください。 ▲ ■関連項目 セルビナ Copyright (C) 2002-2012 SQUARE ENIX CO., LTD. All Rights Reserved.
https://w.atwiki.jp/iwannabethewiki/pages/4790.html
製作者 Medley DL先↓ http //www.mediafire.com/file/qzl8ifkndalie1p/Happy+Birthday+PDplayer%21.zip
https://w.atwiki.jp/touhoukashi/pages/3261.html
【登録タグ A-One Eternal Dream ～ 幽玄の槭樹 H TOHO EUROBEAT VOL.16 永夜抄 あき ビートまりお 曲 月見草 東方妖怪小町 越田Rute隆人】 【注意】 現在、このページはJavaScriptの利用が一時制限されています。この表示状態ではトラック情報が正しく表示されません。 この問題は、以下のいずれかが原因となっています。 ページがAMP表示となっている ウィキ内検索からページを表示している これを解決するには、こちらをクリックし、ページを通常表示にしてください。 /** General styling **/ @font-face { font-family Noto Sans JP ; font-display swap; font-style normal; font-weight 350; src url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/10/NotoSansCJKjp-DemiLight.woff2) format( woff2 ), url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/9/NotoSansCJKjp-DemiLight.woff) format( woff ), url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/8/NotoSansCJKjp-DemiLight.ttf) format( truetype ); } @font-face { font-family Noto Sans JP ; font-display swap; font-style normal; font-weight bold; src url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/13/NotoSansCJKjp-Medium.woff2) format( woff2 ), url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/12/NotoSansCJKjp-Medium.woff) format( woff ), url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/11/NotoSansCJKjp-Medium.ttf) format( truetype ); } rt { font-family Arial, Verdana, Helvetica, sans-serif; } /** Main table styling **/ #trackinfo, #lyrics { font-family Noto Sans JP , sans-serif; font-weight 350; } .track_number { font-family Rockwell; font-weight bold; } .track_number after { content . ; } #track_args, .amp_text { display none; } #trackinfo { position relative; float right; margin 0 0 1em 1em; padding 0.3em; width 320px; border-collapse separate; border-radius 5px; border-spacing 0; background-color #F9F9F9; font-size 90%; line-height 1.4em; } #trackinfo th { white-space nowrap; } #trackinfo th, #trackinfo td { border none !important; } #trackinfo thead th { background-color #D8D8D8; box-shadow 0 -3px #F9F9F9 inset; padding 4px 2.5em 7px; white-space normal; font-size 120%; text-align center; } .trackrow { background-color #F0F0F0; box-shadow 0 2px #F9F9F9 inset, 0 -2px #F9F9F9 inset; } #trackinfo td ul { margin 0; padding 0; list-style none; } #trackinfo li { line-height 16px; } #trackinfo li nth-of-type(n+2) { margin-top 6px; } #trackinfo dl { margin 0; } #trackinfo dt { font-size small; font-weight bold; } #trackinfo dd { margin-left 1.2em; } #trackinfo dd + dt { margin-top .5em; } #trackinfo_help { position absolute; top 3px; right 8px; font-size 80%; } /** Media styling **/ #trackinfo .media th { background-color #D8D8D8; padding 4px 0; font-size 95%; text-align center; } .media td { padding 0 2px; } .media iframe nth-of-type(n+2) { margin-top 0.3em; } .youtube + .nicovideo, .youtube + .soundcloud, .nicovideo + .soundcloud { margin-top 0.75em; } .media_section { display flex; align-items center; text-align center; } .media_section before, .media_section after { display block; flex-grow 1; content ; height 1px; } .media_section before { margin-right 0.5em; background linear-gradient(-90deg, #888, transparent); } .media_section after { margin-left 0.5em; background linear-gradient(90deg, #888, transparent); } .media_notice { color firebrick; font-size 77.5%; } /** Around track styling **/ .next-track { float right; } /** Infomation styling **/ #trackinfo .info_header th { padding .3em .5em; background-color #D8D8D8; font-size 95%; } #trackinfo .infomation_show_btn_wrapper { float right; font-size 12px; user-select none; } #trackinfo .infomation_show_btn { cursor pointer; } #trackinfo .info_content td { padding 0 0 0 5px; height 0; transition .3s; } #trackinfo .info_content ul { padding 0; margin 0; max-height 0; list-style initial; transition .3s; } #trackinfo .info_content li { opacity 0; visibility hidden; margin 0 0 0 1.5em; transition .3s, opacity .2s; } #trackinfo .info_content.infomation_show td { padding 5px; height 100%; } #trackinfo .info_content.infomation_show ul { padding 5px 0; max-height 50em; } #trackinfo .info_content.infomation_show li { opacity 1; visibility visible; } #trackinfo .info_content.infomation_show li nth-of-type(n+2) { margin-top 10px; } /** Lyrics styling **/ #lyrics { font-size 1.06em; line-height 1.6em; } .not_in_card, .inaudible { display inline; position relative; } .not_in_card { border-bottom dashed 1px #D0D0D0; } .tooltip { display flex; visibility hidden; position absolute; top -42.5px; left 0; width 275px; min-height 20px; max-height 100px; padding 10px; border-radius 5px; background-color #555; align-items center; color #FFF; font-size 85%; line-height 20px; text-align center; white-space nowrap; opacity 0; transition 0.7s; -webkit-user-select none; -moz-user-select none; -ms-user-select none; user-select none; } .inaudible .tooltip { top -68.5px; } span hover + .tooltip { visibility visible; top -47.5px; opacity 0.8; transition 0.3s; } .inaudible span hover + .tooltip { top -73.5px; } .not_in_card span.hide { top -42.5px; opacity 0; transition 0.7s; } .inaudible .img { display inline-block; width 3.45em; height 1.25em; margin-right 4px; margin-bottom -3.5px; margin-left 4px; background-image url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2971/7/Inaudible.png); background-size contain; background-repeat no-repeat; } .not_in_card after, .inaudible .img after { content ; visibility hidden; position absolute; top -8.5px; left 42.5%; border-width 5px; border-style solid; border-color #555 transparent transparent transparent; opacity 0; transition 0.7s; } .not_in_card hover after, .inaudible .img hover after { content ; visibility visible; top -13.5px; left 42.5%; opacity 0.8; transition 0.3s; } .not_in_card after { top -2.5px; left 50%; } .not_in_card hover after { top -7.5px; left 50%; } .not_in_card.hide after { visibility hidden; top -2.5px; opacity 0; transition 0.7s; } /** For mobile device styling **/ .uk-overflow-container { display inline; } #trackinfo.mobile { display table; float none; width 100%; margin auto; margin-bottom 1em; } #trackinfo.mobile th { text-transform none; } #trackinfo.mobile tbody tr not(.media) th { text-align left; background-color unset; } #trackinfo.mobile td { white-space normal; } document.addEventListener( DOMContentLoaded , function() { use strict ; const headers = { title アルバム別曲名 , album アルバム , circle サークル , vocal Vocal , lyric Lyric , chorus Chorus , narrator Narration , rap Rap , voice Voice , whistle Whistle (口笛) , translate Translation (翻訳) , arrange Arrange , artist Artist , bass Bass , cajon Cajon (カホン) , drum Drum , guitar Guitar , keyboard Keyboard , mc MC , mix Mix , piano Piano , sax Sax , strings Strings , synthesizer Synthesizer , trumpet Trumpet , violin Violin , original 原曲 , image_song イメージ曲 }; const rPagename = /(?=^|.*
https://w.atwiki.jp/urieliamtykimichael/pages/4.html
ニュース @wikiのwikiモードでは #news(興味のある単語) と入力することで、あるキーワードに関連するニュース一覧を表示することができます 詳しくはこちらをご覧ください。 ＝＞http //atwiki.jp/guide/17_174_ja.html たとえば、#news(wiki)と入力すると以下のように表示されます。 白夜極光攻略wiki - AppMedia(アップメディア) 【カウンターサイド】リセマラ当たりランキング - カウサイ攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) ウィキペディアを作ったiMacが箱付きで競売に登場。予想落札価格は約96万円！（ギズモード・ジャパン） - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース メトロイド ドレッド攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 【グランサガ】リセマラ当たりランキング - グランサガ攻略wiki - Gamerch(ゲーマチ) マニュアル作成に便利な「画像編集」機能を提供開始！ - ナレッジ共有・社内wikiツール「NotePM」：時事ドットコム - 時事通信 マニュアル作成に便利な「画像編集」機能を提供開始！ - ナレッジ共有・社内wikiツール「NotePM」 - PR TIMES 篠原悠希×田中芳樹が明かす「歴史ファンタジー小説ならではの悩み」（現代ビジネス） - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース 【Apex Legends】ヴァルキリーの能力と評価【エーペックス】 - Gamerch(ゲーマチ) モンハンライズ攻略Wiki｜MHRise - AppMedia(アップメディア) 【ウインドボーイズ】リセマラ当たりランキング（最新版） - ウインドボーイズ攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) ポケモンBDSP(ダイパリメイク)攻略wiki - AppMedia(アップメディア) SlackからWikiへ！シームレスな文章作成・共有が可能な「GROWIBot」リリース - アットプレス（プレスリリース） 【ウマ娘】ナリタブライアンの育成論｜URAシナリオ - Gamerch(ゲーマチ) 【ウマ娘】ヒシアケボノの育成論｜URAシナリオ - Gamerch(ゲーマチ) 【ウマ娘】フジキセキの育成論｜URAシナリオ - Gamerch(ゲーマチ) ドラゴンクエストけしケシ攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) サモンズボード攻略wiki - GameWith 【スタオケ】カード一覧【金色のコルダスターライトオーケストラ】 - Gamerch(ゲーマチ) 【スマブラSP】ソラのコンボと評価【スマブラスペシャル】 - Gamerch(ゲーマチ) 【ブレフロレゾナ】リセマラ当たりランキング【ブレイブフロンティアレゾナ】 - ブレフロR攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 【ガーディアンテイルズ】ギルドレイド戦（秘密の研究所）の攻略とおすすめキャラ【ガデテル】 - Gamerch(ゲーマチ) 仲村トオル、共演者は事前に“Wiki調べ”（オリコン） - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース 【ENDER LILIES】攻略チャートと全体マップ【エンダーリリィズ】 - Gamerch(ゲーマチ) 【ウマ娘】あんしん笹針師の選択肢はどれを選ぶべき？ - Gamerch(ゲーマチ) 【ポケモンユナイト】アップデート情報・キャラ調整まとめ - ポケモンユナイト攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 【Apex】シーズン11の新要素と最新情報まとめ【エーペックス】 - Gamerch(ゲーマチ) ロストジャッジメント攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 【Among us】新マップThe Airship（エアシップ）の解説【アモングアス】 - Gamerch(ゲーマチ) ハーネスについて小児科医の立場から考える（坂本昌彦） - 個人 - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース ゼルダ無双攻略Wiki｜厄災の黙示録 - AppMedia(アップメディア) 【テイルズオブルミナリア】リセマラ当たりランキング - TOルミナリア攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) ウマ娘攻略Wiki - AppMedia(アップメディア) ゲトメア（ゲートオブナイトメア）攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 【白夜極光】リセマラ当たりランキング - 白夜 極光 wiki - Gamerch(ゲーマチ) お蔵入りとなった幻の『スーパーマリオ』 オランダの博物館でプレイ可能？（リアルサウンド） - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース ナレッジ共有・社内wikiツール「NotePM」が「ITreview Best Software in Japan 2021」のTOP50に選出 - PR TIMES 真女神転生5攻略Wiki｜メガテン5 - AppMedia(アップメディア) 【B4B】近接ビルドデッキにおすすめのカード【back4blood】 - Gamerch(ゲーマチ) ポケモンスナップ攻略wiki - AppMedia(アップメディア) 富野由悠季「ブレンパワード」作り直したい！ファンを前に意欲（シネマトゥデイ） - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース 【スマブラSP】カズヤの評価とコンボ【スマブラスペシャル】 - Gamerch(ゲーマチ) ナレッジ共有・社内wiki「NotePM」が「ITreview Grid Award 2021 Fall」で、チームコラボレーションとマニュアル作成部門において「Leader」を5期連続でW受賞！ - PR TIMES メモ・ドキュメント・wiki・プロジェクト管理などオールインワンのワークスペース「Notion」が日本語ベータ版提供開始 - TechCrunch Japan 【ギアジェネ】リセマラ当たりランキング【コードギアス】 - ギアジェネ攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) モンスターファーム2(MF2)攻略wiki｜アプリ・Switch移植版 - AppMedia(アップメディア) 文芸誌『早稲田文学』のホラー特集号が発売開始。ガッチマン氏とVTuberらとの「ホラーゲーム実況対談」のほかSCP財団やChilla s Artも（電ファミニコゲーマー） - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース 【ブラサジ】最強キャラTierランキング【ブラックサージナイト】 - Gamerch(ゲーマチ) 【パワプロ】鬼滅の刃コラボ情報まとめ - Gamerch(ゲーマチ) 【SPAJAM2021】第3回予選大会は「クイズ!WIKIにゃんず!」を開発したチーム「かよちゃんず」が最優秀賞！ | gamebiz - SocialGameInfo 【パワプロ】鬼滅の刃コラボガチャはどっちを引くべきか - Gamerch(ゲーマチ) 検索結果における「ナレッジパネル」の役割とは・・・ウィキメディア財団とDuckDuckGoの共同調査 - Media Innovation 【ウマ娘】解放結晶の入手方法と使い方 - Gamerch(ゲーマチ) ナレッジ共有・社内wikiツール「NotePM」が「BOXIL SaaS AWARD 2021 Autumn」にて「コラボレーション部門」を受賞！ - PR TIMES Wikipediaが「中国人編集者の身の安全を守るため」に一部の編集者アカウントをBANに - GIGAZINE 【ドッカンバトル】3.5億ダウンロードキャンペーン最新情報 - ドッカンバトル攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) BTS（防弾少年団）のV、8月のWikipedia閲覧数が韓国アーティストで1位！グループでは4ヶ月連続トップ - Kstyle 【イース6オンライン】リセマラ当たりランキング｜召喚ガチャの開放条件は？ - Gamerch(ゲーマチ) BacklogからNotePMへwiki情報を自動API連携する「Backlog to NotePM」をSaaStainerに掲載開始 - PR TIMES ライザのアトリエ2攻略Wiki - AppMedia(アップメディア) 真女神転生3リマスター攻略Wiki｜メガテン3 - AppMedia(アップメディア) タスクも文書もWikiもデータベースもまとめて管理できる「Notion」とは？ - ASCII.jp ナレッジ共有・社内wikiツール「NotePM」が、見るだけ専用ユーザー『無料』の新プランを発表！ - PR TIMES 【かのぱず】リセマラ当たりランキング【彼女お借りします】 - Gamerch(ゲーマチ) 【乃木フラ】リセマラの必要はある？【乃木坂的フラクタル】 - Gamerch(ゲーマチ) 【パワプロ】生放送まとめ｜パワフェス2021 - パワプロ攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 【ポケモンユナイト】サーナイトのおすすめビルド（わざ・持ち物） - Gamerch(ゲーマチ) ルーンファクトリー5攻略wiki｜ルンファク5 - AppMedia(アップメディア) シャーマンキングふんばりクロニクル攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) アーテリーギア‐機動戦姫-攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 簡単操作で自分専用Wikiを構築できるMarkdownエディタ「Obsidian」のモバイル版を使ってみた - GIGAZINE 情報マネジメントツール「Huddler」がwiki機能を刷新 - PR TIMES シェアエコ配送アプリ「DIAq(ダイヤク)」のアンカーアプリで、高層ビル・商業施設の入館方法などお役立ち情報をまとめた「DIAqwiki」を公開 - アットプレス（プレスリリース） 異常熱波のカナダで49.6度、いま北米で起きていること（森さやか） - 個人 - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース 【ツイステ】マスターシェフの攻略～辛味のふるさと～【料理イベント】 - Gamerch(ゲーマチ) 【ラグナロクオリジン】リセマラは不要？おすすめ職業は？【ラグオリ】 - Gamerch(ゲーマチ) 【バイオミュータント】2.02アプデ｜アップデート1.4情報 - バイオミュータント攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) ニーアレプリカントリメイク攻略wiki｜ver.1.22 - AppMedia(アップメディア) 【ウマ娘】ゴルシウィークはいつから？キャンペーン情報まとめ - Gamerch(ゲーマチ) シーズン66 - 【超速GP】ミニ四駆 超速グランプリ攻略まとめwiki - 電撃オンライン 乃木坂的フラクタル攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 「こんなことになるとは…」13年前のエイプリルフールについた“嘘”がネットで… ある男の告白（BuzzFeed Japan） - Yahoo!ニュース - Yahoo!ニュース 整理不要の情報共有ツール(社内Wiki)「Nerve」シードラウンドで総額約3500万円の資金調達を実施 - PR TIMES Nerve - 整理不要の情報共有ツール(社内Wiki) ローンチカスタマー募集開始のお知らせ - PR TIMES 終末のアーカーシャ（終アカ）攻略wiki - Gamerch(ゲーマチ) Among Us攻略Wiki【アマングアス・アモングアス】 - Gamerch(ゲーマチ) パニシンググレイレイヴン(パニグレ)攻略wiki - Gamerch(ゲーマチ) 【ひなこい】最強ひな写ランキング - ひなこい攻略Wiki - Gamerch(ゲーマチ) 稲作アクションRPG『天穂のサクナヒメ』における「農林水産省攻略wiki説」は本当なのか？ - AUTOMATON スタスマ攻略Wiki【スタースマッシュ】 - Gamerch(ゲーマチ) 無料とは思えない多機能っぷりなWikiインフラ「Wiki.js」レビュー、自前でホスト＆外部サービスと連携可能 - GIGAZINE Microsoft Teamsの基本と活用(24) TeamsのWikiを使う - マイナビニュース 『ゲーミングお嬢様』での提起が話題に “企業系wiki”に横たわる問題点とは - リアルサウンド 「エイリアンのたまご」，自動周回機能と公式wikiが登場 - 4Gamer.net 【リゼロス】Re ゼロから始める異世界生活 Lost in Memories攻略まとめwiki - 電撃オンライン ヌーラボ、「Backlog」の絵文字入力の補完機能やWiki編集の自動マージ機能を改善 - CodeZine（コードジン） ヌーラボ、プロジェクト管理ツール「Backlog」の絵文字入力の補完機能・Wiki編集の自動マージ機能を修正改善 - PR TIMES Backlog、Wikiにファイル添付が容易にできる機能をリリース -- グローバルバーの視認性改善なども実施 - PR TIMES GK川島、パンチング失点でWiki書き換え炎上 「セネガル代表」「プロボクサー」... - J-CASTニュース ツムツム攻略Wiki｜ゲームエイト - Game8[ゲームエイト]