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【BE HAPPY!? 裏街クリニック】 【ようせいたちのひみつのもり】 制作コメント スペシャルコード特典 キャラクター 関連リンク 不思議な病でお困りですか？ 恋わずらいから誰にも言えないお悩みまで 秘密厳守、即日対応をお約束。 静まる街の向こう側、秘密のクリニックで スタッフ一同お待ちしております。 Illust mayo ポップンミュージック eclaleのポップンミュージックカード第2弾に登場したレアカード。 スペシャルコードが存在する。 全体的に黄色～茶色がかった感じの色合いが特徴。 ここでの院長はヴァイスだろうか。 天井にクモの巣があったりと、何かしらの怪しい雰囲気があるようだが・・・・・・？ +... 制作コメント レアカード担当させて頂くに当たり、お題を頂きましたよ。病院関連のキャラが集まったカード。お題名は『おだいじに』ふむふむ。病院で「お大事に」って言えば、優しいお姉さんが明るく柔らかな笑顔で見送ってくれる感じであろうな。。"%（・v・）～♪ざっとした下絵を描くと、なんと…！！！"（oдo；）￢思いっきり逆方向になってる！？？という訳で、クリニックの方向性を真逆にして仕上がったレアカードです。…でもでも、腕はきっと確かです。たぶん、奇跡の手を持ったドクター！難病・奇病もたちどころにってヤツです！！集まった面子に一抹の不安を感じながらも。。真面目そうなヴァイスさんを信じてますッ！容子さんは貧血はおこしても、立派な！看護士さんだしネ！Illustrator mayo スペシャルコード特典 ポップンスターメーカーのSPECIALエリアで、ヴァイスのメダルが獲得できる。 キャラクター ヴァイス ドクタージジー＆キャンキャン 薬子ちゃん モニモニ（成長した姿） サンパウロ容子 ドクターフラスコ 関連リンク レアカード ポップンミュージックカード/ポップンeclale/Vol.2 カードリスト（ポップンミュージックカード）
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ver 曲名 アーティスト BPM XG3 I m so Happy (Rockin ver.) Ryu☆ 181 難易度 LEVEL NOVICE 1.80 REGULAR 5.20 EXPERT 7.35 攻略・コメント 譜面指定については【紫】など文頭に指定をお願いします。 【赤】ｄｋｄｋが何回か襲ってくるが、その多くは手の絡みが極端に少ない。よってここは足のリズムキープに集中するのが吉。テンポは速めだがｄｋｄｋひとつひとつの長さはさほどでもない（最長1小節分）ので、意外と繋ぎやすい -- 名無しさん (2012-10-11 21 39 33) 名前 コメント
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二階堂 大和[Happy Sparkle Star!] 稀有度 SHOUT BEAT MELODY SSR 3903 3514 6224 隊長技 隊伍的Melody值有100%的機率大幅提高 魅力技能 身經百戰的衝鋒隊長 效果 LV.1 連擊判定每21次就有28%的機率使分數提高600 LV.2 連擊判定每20次就有30%的機率使分數提高1050 LV.3 連擊判定每19次就有32%的機率使分數提高1785 LV.4 連擊判定每18次就有34%的機率使分數提高3034 [部分編集] 台詞 我的兒時玩伴要去的話，那我也只能跟啦 取得方式 特別登場！主題服裝高級甄選第2彈開始！、3種復刻限定高級甄選開跑!!、4th Anniversary!!附贈白金i7收集冊付費星石復刻限定高級甄選登場！、4th Anniversary!!2種復刻限定高級甄選開跑!!、僅限1次！付費星石半價 動畫第3季紀念高級甄選開始!! RC 第1話 Sparkle12 信賴度5% 第2話 Fastasy 信賴度20% 第3話 勿忘童心 信賴度40% 第4話 殺青 信賴度80% 第5話 Sparkle Star 信賴度100%+SSR Lv.55
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生徒名簿 ＞ 日向湊 ＞［HAPPY FLOWER］日向湊(SR) ※ボイスやアピールボイス、ストーリーはありません。また、アルバイトやデート、進展もできません。 [HAPPY FLOWER]日向湊(SR) 攻魅力 3641 守魅力 3498 攻Ｍ 21939 守Ｍ 21075 コスト 17 卒業祝い 20000メン アピール 今日は気分もイイし、遊んでやるよ。 └Kingタイプの攻守魅力大UP ストーリー なし 入手方法 台詞 マイページ +... あんた、今オレに見惚れてただろ。 あんたのプレゼントか、最高だな。 今日はキスのプレゼントもくれるんだよな？ 登校 +... 朝 お誕生日のケーキは先輩の手作りがいいなぁ！ 今から作ってぇ！ そういや今日はオレの誕生日か。あんたに何してもらおうかな？ ……バースデーケーキを買えば景気が良くなる……。 放課後 あんたが笑ってくれるだけで、うれしいプレゼントになるな。 誕生日でもそうじゃなくても、デッサンは毎日やるって決めてる。 [名前]、会いにきたぞ。今日はずっとあんたと一緒にいたくてさ。 夜 今夜はうちに来いよ。ふたりきりでオレを祝ってくれるだろ？ まだ大事なプレゼントもらってないぞ……あんたからのキスだよ。 もう夜か、一緒に帰ろうぜ。……夜は家に戻んナイト……。 カレ自慢 +... 対決画面 ― やってやるよ、かわいいあんたの為だ。 告白タイム +... 戦闘中台詞 ― 勝利 ― 敗北 ―
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Happy Feet Two The Videogame 項目数 45 総ポイント 1000 難易度 ★☆☆☆☆ 北米版リージョンフリー。 実績コンプまで8時間程。 オフラインCoopのため要2コン。 同時にプレイする必要なく、一人二役で実績コンプ可能。 Don’t Stop ‘Til You Get Enough Win your first Race(レースで初勝利する) 10 ABC Complete a level(Levelをクリアする) 10 Blaze Of Glory Collect 100 Black Music Notes(音符を100個集める) 10 Close To You Assemble a group of 3 penguins(3羽のペンギンを引き連れる) 10 Beat It Stay on the beat for 20 beats(20回連続でビートを刻む) 10 Rhinestone Cowboy Collect the most notes in a Bonus Level in co-op(co-op時にBonus Levelで一番多く音符を集める) 10 You’ve Got A Friend Switch control between characters(操作キャラを切り替える) 10 Wind Beneath My Wings Fill the boost bar in a Race(レース時にブーストバーを満タンにする) 10 Wannabe Complete three stunt hoops in a single Race(1回のレースで3回stunt hoopを成功させる) 10 The Way We Were Revisit a previously played level(クリアしたレベルを再プレイする) 10 Jump Jump off three stunt ramps in a Race(レース時に3回ジャンプ台からジャンプする) 10 Let’s Go Crazy Perfectly perform a Dance Combo and a Stomp Combo in quick succession(Dance ComboからStomp Comboを素早くキメる) 10 Sledgehammer Smash five Stone Columns(石の柱を5回崩す) 10 I Feel The Earth Move Smash three Ice Boulders at the same time(氷塊を3つ同時に崩す) 10 You Make Me Feel Like Dancing Convert 3 Penguins at the same time(3羽のペンギンを同時に惹きつける) 10 Step By Step Beat a Boss without making a mistake in co-op(co-op時にボス戦をミスせずにクリアする) 10 Blinded By The Light Collect a Disco Fish(Disco Fishを手に入れる) 10 Drop It Like It’s Hot Destroy 10 objects during Disco Fish mode(Disco Fish mode時に10個のオブジェクトを壊す) 10 Ice Ice Baby Move five Ice Slide Blocks(滑るブロックを5回動かす) 10 Shake Ya Tailfeather Wake up five Sleepy Penguins(寝ているペンギンを5回起こす) 10 Out Of Touch Complete Level 28 without getting hurt(Level 28をノーダメージでクリアする) 20 Nothin’s Gonna Stop Us Now Complete a Race without hitting anything(レースステージを衝突なしでクリアする) 20 Never Gonna Give You Up Win every Race(全てのレースに勝つ) 20 Joy Ride Activate 20 moving platforms(動く床を20回作動させる) 20 You Ain’t Seen Nothin’ Yet Complete Emperor Land(Emperor Landをクリアする) 20 Ebony Ivory Complete Adelie Land(Adelie Landをクリアする) 20 I Don't Wanna Miss A Thing Complete Elephant Seal Land(Elephant Seal Landをクリアする) 20 Don’t Go Breaking My Heart Complete a level with full health(Levelを体力満タンでクリアする) 20 Convoy Assemble a group of 5 penguins(5羽のペンギンを引き連れる) 20 Physical Scare 20 Skua Birds(トウゾクカモメを20回怖がらせる) 20 Celebration Collect 200 black notes in one level(1つのLevelで音符を200個集める) 20 Good Vibrations Activate all the Vibes in one Level(1つのLevelで全てのVibesを見つける) 20 Don’t Worry, Be Happy Clap 108 times(108回手拍子する) 20 Rock With You Complete five levels with every penguin in the level(5つのLevelで全てのペンギンを引き連れてクリアする) 20 Bridge Over Troubled Water Cross 50 Ice Rails(50回氷のレールを渡る) 20 That’s What Friends Are For Complete the game(ゲームをクリアする) 50 Take On Me Complete an entire game in Co-Op(全てのLevelをco-opでクリアする) 50 Heart Of Gold Complete the last level of a Land with full health(Landの最後のレベルを体力満タンでクリアする) 50 We Built This City Bring 200 friends to the Doomberg(Doombergに200羽の仲間を連れて行く) 50 Another One Bites The Dust Beat a Boss without making a mistake(ボス戦をミスせずにクリアする) 50 Gold Digger Unlock all songs(全てのsongをアンロックする) 50 Runaway Level up all songs(全てのsongをレベルアップさせる) 50 Satisfaction Collect 2000 Black Notes(音符を2000個集める) 50 Eye Of The Tiger Defeat every Boss without making a mistake(全てのボス戦をミスせずにクリアする) 50 Rapture Hit every stunt hoop in a Race(1つのレースで全てのstunt hoopを成功させる) 50 ■実績解除全般 全54ステージでステージセレクトあり。 ステージ数は多いが1分以内にクリアできるボーナスステージがいくつか含まれる。 全てのステージ(レース、ボス含む)でCoopでクリアする、という実績があり Coopクリアの進捗状況がゲーム内で表示されないため1周目は必ず乱入してCoop状態で終えることを心がけるのと ボスステージを全てノーミスという実績があるのでそれも多少意識するとよい。 またを全曲レベル7にするという実績があるのでレベル7になったら次の曲を選ぶこと。 1周した後ステージセレクトでボスやレースの実績、曲の経験値稼ぎを行うと効率が良い。 初回周回中は音符をできるだけ集めると終了後の作業量が軽減する。 レースステージ：9 16 20 31 36 48 ボスステージ：7 13 15 23 30 38 47 54 ボスステージは初見でノーミスが出来るものと多少難しいものもあるが全般的に難易度は低い。 基本操作になるが通常ステージでのStomp Comboを意識するとするとよい。 YボタンでStompができるのだがタイミング良く押すと3回目に衝撃波が出るStomp Comboが行える。 タイミングは腕を下げる動作始めるの時、それほど難しくはない。道中の雪塊の破壊やカモメを追い払うのに非常に役に立つ。 また、Xボタンをタイミングよく押すとDance Comboになるのだが4回目の回転ダンス時に周囲の音符を引き寄せ回収してくれるのでそれも意識するとよい。 余談になるが、このゲームの実績名は全て往年のヒット曲のタイトルになっている。 Beat It Xボタンをタイミング良く20回押すと解除。 通常ステージ中にペンギンを仲間にする場面が多々あるが、その際同じリズムで行えばよい。 Physical Emperor Penguinを引き連れた状態で、カモメのそばでStomp Comboをするとカモメを追い払える。これを20回。 Good Vibrations 各ステージに3箇所ずつコントローラーが振動する場所に音符が隠されており、その近くでダンスを踊ることで獲得できる。(初回のみチュートリアル有り) いつでも解除できるが、ステージが狭い序盤のうちに解除しておくのが楽。 Out Of Touch Stomp Comboを行えば衝撃波で敵のカモメをピヨらせれば安全にクリアできる。 Nothin’s Gonna Stop Us Now/Heart Of Gold レースステージでは、CPUがゴールした時点でクリア扱いになるので、ステージ9でLTを引きっぱなしにしてゆっくり進めばよい。 Never Gonna Give You Up coopクリア時に2コンが勝ってしまうと勝利にカウントされない。 Take On Me 全ステージCo-opでクリアする。各ステージのゴール直前で2コンで乱入すればOK。 レースステージではどこがゴールかは判断しにくいのである程度進んだところで2コンを乱入させる。最初から放置すると障害物にぶつかりまくって体力が持たないこともあるので注意。 ボスステージではとどめの連打の時に2コンを乱入させるだけでよい。 2コンは無線コントローラーだと接続切断の作業がしやすい。 Gold Digger 通常のプレイですべての曲を集めることができるくらいの音符が稼げる。 Runaway 全曲レベル7(MAX)にする必要がある。クリア後にステージ34を繰り返すのが早い。 1曲MAXにするのにステージ34を5周～6週する必要がある。 スタート時に右手に見える銀色音符を回収すると確実に5周で終わる。 Rapture 本ゲームにおいて一番難易度の高い実績。一つのレースのstunt hoopをすべて成功させる。 stunt hoopの成功には ①スタントフープに触れる ②スタントを行い、ダメージを受けずに着地する この①＋②で成功とみなされる模様。 コツとしてはジャンプ台にまっすぐ入る、RTでブーストしてAボタンを押してジャンプする、スタントしてきれいに着地するするの3つだが ジャンプ台の位置を覚えて道中はブーストは使わず、ジャンプ台が見えたら ブーストしまっすぐに入ることを重視したほうが成功率が高いと思われる。 道中の雪塊にぶつかりスピードが0になってしまうと失敗する可能性が非常に高い。 ステージ9だとフープは6つ。 解除タイミングはレース終了後ではなく最後のstunt hoopが成功した時。
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BE HAPPYギルドwikiについて 当wikiはBE HAPPYギルドメンバー専用のページとなっております。 メンバー同士の情報交換等にご利用いただければと思います。 また、常に最新の情報を掲載するつもりでおりますので、 何か新着情報等ございます場合、各自編集いただくか、マスターまで ご一報いただければと思います。 (3/28追記) 現在、公式ページがまだアップされていないため、こちらを暫定的に 当ギルドページとして利用していきたいと思っております。 どうぞ宜しくお願いします。 (作業用PCがこんな時にね…うん…orz)
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【登録タグ A-One Eternal Dream ～ 幽玄の槭樹 H TOHO EUROBEAT VOL.16 永夜抄 あき ビートまりお 曲 月見草 東方妖怪小町 越田Rute隆人】 【注意】 現在、このページはJavaScriptの利用が一時制限されています。この表示状態ではトラック情報が正しく表示されません。 この問題は、以下のいずれかが原因となっています。 ページがAMP表示となっている ウィキ内検索からページを表示している これを解決するには、こちらをクリックし、ページを通常表示にしてください。 /** General styling **/ @font-face { font-family Noto Sans JP ; font-display swap; font-style normal; font-weight 350; src url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/10/NotoSansCJKjp-DemiLight.woff2) format( woff2 ), url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/9/NotoSansCJKjp-DemiLight.woff) format( woff ), url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/8/NotoSansCJKjp-DemiLight.ttf) format( truetype ); } @font-face { font-family Noto Sans JP ; font-display swap; font-style normal; font-weight bold; src url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/13/NotoSansCJKjp-Medium.woff2) format( woff2 ), url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/12/NotoSansCJKjp-Medium.woff) format( woff ), url(https //img.atwikiimg.com/www31.atwiki.jp/touhoukashi/attach/2972/11/NotoSansCJKjp-Medium.ttf) format( truetype ); 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質問対策 だいたいこんなもの？ こんなかんじ。 こんなかんじ。 ＦＬＩＭに最低限必要なこととは？ １．８０ＭＨｚのパルスレーザー ２．高感度の光電子増倍管 ３．ナノ秒オーダーで蛍光寿命を取得するハードウェア 脂質とプローブの関係はどうなっているのか？ 普通培養細胞は、１ｐｌくらいだと考えられています。 スパインの中は０．１ｆｌから０．０１ｆｌくらい 大体、１００倍くらいだと考えられます。 大体、ＤＡＧは、１ｆモルです。一細胞に。 だから、１０あぷとモルくらいある。（この計算はおかしい。神経の場合、スパインは特別だと考えられる） ＰＩＰ３の場合は、その１００倍くらい少ないから。１００ゼプト盛るくらいあります。これが、刺激によって１０倍くらいに変わるといわれています。 脂質プローブと脂質の結合能は、かなり高いですから、始めから結合していると考えられます。ここで、刺激が加わると、破壊分析の結果などを参考にしますと１０倍から最大で５０倍くらいの脂質ができます。これに、プローブが反応して応答するということになります。これは、プローブ全部を応答させるための量く シグナル伝達に関わるタンパク質は、タンパク質は、数十個あると言われている。よって、それに応答するPIP3も同様にそのレベルあるのではないかと推測します。プローブ分子は膜タンパク質で、蛍光を見ればわかるとおり、極めて量は少ないです。タンパク質の発現量は10-6Mくらいですから、スパインの容量が0.01flくらいだとすると、大体数十個くらいあると考えられます。よって、PIP3、プローブが大体数十個くらいずつあると想定してもらえれば大丈夫です。普通のPMTではなく、Gasp detectorを用いて観測しております。 1. In this presentation, you don t mention SHIP protein. How do you think SHIP protein is involved in this pathway? Thank you very much for good question. Exactly, SHIP is the protein that degrades PIP3 to PI(3,4)P2. I did not examine the effect of SHIP on spinule formation. Some paper shows that SHIP is not expressed in HP. Anyway it is very interesting to know the effect of SHIP on spinule formation. 1.0 How did you analyze spinule formation? It is pretty difficult that as you know spinule is very fine structure. So it is pretty difficult to observed. In our study we used the hamahoto H7422 Gasp detector. Spinules that protruded from the spine head were counted. Each synaptic spinule, regardness of its size and orientation, was scored as in previous studies (Tao-Cheng et al., 2009) And we did analyze the circularity. The effect of PTEN inhibitor, which increses PIP3, reduced the circularity. In the case of PI3K inhibitor, which decreases PIP3, there was the tendency that circularity increases but no significant difference. 1. 1. PIP3 or PIP2? very good question. This study is in the middle of revise. Reviewer pointed out about this point. I am looking for the protein of downstream of PIP3 such as Akt protein. And basically PIP2 is 100 times more than PIP3. even though PIP3 increase or decreases, PIP2 level is not reflected. So I think that PIP3 is the factor to regulate spinule formation. 1. 2. The relationship between schizophronia and PIP3 Inositol metabolism is deeply related to the depression and bipolar disorder. Because old days drug lithium is well known to work this pathway. currently it seems that lithium effects the GSK3beta. And PTEN mutant causes coden disease, which is accompanied by sometime mental reterdation. So PIP3 and inositol metabolism is related to the disease like these. But I think there is mainly two cause inositol metabolism regulates such a diseases. One is that PIP3 regulates the neuronal development in develop brains. The other is synapse function after neuron grown up. In the present study, I examined the effect of PIP3 on spine morphology. In near future, I want to examine the effect of PIP3 on neuron development. In some part, Dr. sheng reveal that PIP3 regulates the dendritic arborization though. 1.3 How about the mobility of PIP3 側方拡散lateral diffusion is roughly 1 microm/sec. But Dr. Kusumi shows that there is some barria mechanism which prevent the lateral diffusion of lipids. The molecules is surrounded by the fenses the size is 30 to 200 nm. So we cannot say that PIP3 is easily do the lateral diffusion. 1.4 PIP3 and raft Basically PIP3 fatty acid composition is steroyl and arachidonyl. 1.5 Did you try RNAi for PI3K and PTEN I tried PTEN RNAi. But I don t analyzed yet. 1.6 Did you check the decrease in PIP3 in the presence of PI3K inihibitor? Yes, I did it. I observed PIP3 reduction and increase in the presense of PI3K and PTEN inhibitor respectively in this figure. In the presence of PI3K inhibitor, PIP3 decrease more in spine than dendritic shaft. In the presence of PTEN inihibitor, PIP3 increase more in dendritic shaft than spines. Previously several paper shows that PTEN is localize in the dendritic shaft. Also some paper showed that PI3K is localized in spines and dendrites, but PI3K directly binds to AMPA receptors, leadting to PI3K activation. This data answers that why PIP3 is accumulated in the spines. 2. In the middle of glutamate uncaging, is PTEN related to this decrease? At first, I expect that PIP3 decrease during glutamate ungaging is due to PTEN. But I examined the effect of PTEN inhibitor on PIP3 decrease during glutatate uncaging. There is no obvious difference with or without PTEN inhibitor about PIP3 decrease. So I think this decrease of PIP3 is mainly due to menbrane insertion. 3. PTEN is dual phosphatase? Did you remove the possiblility PTEN phosphatase activity works in this pathway? Exactly PTEN has dual phosphatase activities. burabura. 4. PIP3 is involved in the functional plasticity? and structural plasticity? As I showd in introduction, there is no doubt that PIP3 regulates functional plasticity. 5. Does PIP3 regulate spinule length? Actually PIP3 regulates the number of spinule. But the length of spinule is not regulated by PIP3. 6. Explain the FLIM more. 7. What is the strength of FLIM compared to FRET? Previously I developed the ratiometric FRET probes including PIP3 and DAG probes. In the case of ratiometric-based FRET probe, in the thick tissues like hippocampal slice, wave-dependent fluorescence absorabance is gonna happen. We cannot measure appropriate FRET efficiecy. So I newly developed the florescence lifetime-based probe. Fluorescence lifetime never change even though thick tissues. That is the strength of FLIM. 8. PI3K works in the middle of glutamate uncaging? I did the experiment to see the effect of PI3K inhibitor on PIP3 concentration during glutamate uncaging. But there is no significant difference between with or without PI3K inhibitor. This means that enzymatic induced PIP3 is extremely little compared to dilution of PIP3 which is caused by membrane insertion. But if we want to observe more detail PIP3 dynamics which is caused by the PI3K or PTEN during glutamate uncaging, I plan to do this experiment as follows. At first I make the situation that spine size doesn t change even during glutamate uncaging using cytokarasin and catrunculin, which is inhibitor for actin polymerization. In this situation I am gonna measure the PIP3 increase or decerase. So I can observe real PIP3 change not induced by membrane insertion. 9. What is the down stream pathway of spinule formation? 10. What is the most difficult point for this work? How did you take over this problem? 11. What number of PIP3 is there in spine? Rough caluculation is 10-100 number of PIP3. How about the number and length of spinule ? raft and PIP3. my probe is subjected with palmitoyl and farnesyl modification. Recently raft proteins clustering regulate the localization of N-Ras. At least I get the response of FLIMPA3 in culture and neurons. The important proteins including PI3K is localized in raft. So PIP3 also localized in raft. But it is very interesting to discriminate the PIP3 production or reduction in raft or non-raft. 神経細胞の樹状突起には約1万個のシナプス結合があります。人が記憶する前と後で、脳の中で何かが変わっているはずです。実際、シナプスで電気の通り方などが変化することから、この一つ一つのシナプスは記憶の最小素子だと考えられています。故に、個々のシナプスの特徴を知ることは、記憶のメカニズムを探る上でとても重要です。個々のシナプスは、入力をうける神経細胞から別々に入力を受けるので、独立に働いていると考えられる一方、クロストークという減少もあります。これは、一つのシナプスに入力が起きたときに、隣接するシナプスに影響を及ぼし、隣接するシナプスで入力を受けやするするということであります。 スパインがクロストークすることはどのような意義があるのでしょうか？りんごというものを覚えたとしましょう。そのときにあるシナプスが活性化し、その付近のシナプスとクロストークします。そのときに、りんごの性質、あかい、おいしいなどの情報が近くに入力しやすくなれば、今度思い出すときに、効率がよいと考えられる。シナプス間のクロストークは、このような思考の分子レベルでのモデルとなるのではないか？と考えております。 クロストークを引き起こす因子として、従来からいろいろな因子が報告されてきました。一酸化窒素、アラキドノイルグリセロールなどの因子は、細胞膜を超えて、隣のシナプスのシナプス前膜に作用するなどの報告がありました。２００７年にラスたんぱく質が樹状突起を通って、隣のシナプスに作用することが報告されました。私は、このシナプス間のクロストークに関わる因子の一つとして、脂質シグナルがあるのではないかと考えました。脂質シグナルは、シナプス前膜からグルタミン酸が放出されるとシナプス後膜のグルタミン酸受容体が活性化し、ＰＩＰ２からホスホリパーゼＣによって、ＤＡＧ，ＰＩ３ＫによってＰＩＰ３が産生されます。ＤＡＧは、神経細胞の分化などに関わるシグナル、ＰＩＰ３は、アポトーシスに関わるシグナルを制御することが知られています。 脂質シグナルだと考える根拠は、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置すること、特にＰＩＰ３は、グルタミン酸などの刺激入力を受けた後、分解されずに数時間持続することが知られ、１秒間に０．５マイクロメートル側方拡散され、隣接するシナプスに到着することができるからです。この結果、この脂質シグナルが、隣接するシナプスに移動し、隣接するシナプスに入力を受けやすくなるのではないかと考えました。 では、どうやってこの脂質シグナルを測るかですが、従来までの脂質シグナルの測定法は、破壊分析に頼っていたために、一個一個のシナプスの個性を失っていました。そこで、生きた神経細胞で見るために、私が現在までに開発したＦＲＥＴプローブ分子を用いようと考えております。このプローブの特徴は、２つあります。１つは、脂質結合ドメインを変えることによって、様々な脂質を見ることができること。従来までに、ＤＡＧおよびＰＩＰ３のプローブを作ってきました。２つ目は膜に局在していることです。従来までに、脂質を見るためのプローブ分子として、GFPと脂質結合たんぱく質の融合プローブがよく使用されている。脂質が細胞膜で増加した際、プローブ分子が膜に移行することによって増加を確認できる。しかしながら、スパインおよび樹状突起は細胞体とつながっており、脂質プローブがスパインまたは樹状突起の膜に移動した際、細胞体にあるプローブがスパインに流れ込み、バックグランドのノイズとなる。申請者のプローブ分子は、膜に局在しているために、バックグランドがないため、スパインおよび樹状突起での脂質の動態を見るために優れている。これは、脂質シグナルをシナプスにおいて観察することができる能力を有しております。 実験においては、この作製した脂質ＦＲＥＴプローブを海馬スライスに遺伝子銃によってトランスフェクションします。次に、詳細は省きますが、自作の２光子顕微鏡を用いて、神経細胞を観察します。図のように樹状突起およびスパインが観察されます。 次に、プローブを発現した神経細胞のひとつのシナプスを刺激します。顕微鏡下で、神経細胞はこのように観察されます。２００４年にひとつのシナプスを刺激する方法が開発されました。まず、グルタミン酸前駆体をインキュベートします。一つのシナプスの近傍に光刺激を行うと、この限られた範囲でグルタミン酸が産生され、シナプスが刺激されます。これによって、脂質のシグナルがどのように起きるのかを観察します。また、図を観察すると刺激を受けたスパインだけ大きさが大きくなっていることがわかります。シナプスはある一定以上の強さの入力を受けることで、このように大きさを変えます。これは、このシナプスがこの入力を記憶したということを示しています。申請先研究室では、このシステムをいち早く取り入れ、８０％以上の確率でシナプスサイズを変えることが可能であります。 そこで、一年目では、2光子顕微鏡のセットアップを行う。それと同時に、ＰＩＰ２，ＤＡＧ，ＰＩＰ３のプローブ分子をＦＬＩＭプローブに変える。 ２年目では、一つのシナプスを刺激し、脂質シグナルがどの程度、どのくらい樹状突起まで伸びていくのかなどの、基本的な情報を得ます。時間的には、グルタミン酸産生に伴い脂質シグナルが活性化しＰＩＰ２は、基質であるために、減少し、ＤＡＧおよびＰＩＰ３は増加すると考えられます。しかしながら、ＤＡＧは破壊分析の結果から一過性、ＰＩＰ３は、持続すると期待できます。 ２年目は、脂質シグナルが届くシナプスと届かないシナプスに刺激を与え、光刺激がどの程度の刺激の強さで、スパインの大きさが変わるかを調べます。 脂質シグナルが届く範囲のスパインは、より弱い光刺激で大きくなるのではないかと期待します。 次に、脂質の移動を止めるために、セプチンたんぱく質を強制発現します。発現します。このたんぱく質は、図のようにスパインネックに発現します。緑がＧＦＰセプチン、赤は神経細胞の形状のマーカーです。セプチンは３ｎｍほどのたんぱく質でこれらがオリゴマーを形成し、スパイン脂質の移動を阻害します。この状態で、一つのシナプスを刺激します。すると脂質の移動は阻害されますから、隣接するスパインの大きさの変わり方は、遠くのシナプスと変わらないのではないかと推測できます。 この実験によって、脂質シグナルがシナプスのクロストークに必要であるかを検証します。 本研究では、 申請者が現在までに培ってきた脂質の知識 および蛍光プローブ分子を現所属研究室に導入する 現研究室にある２光子顕微鏡グルタミン酸光分解システムを用いる。 スパインにグルタミン酸刺激を与えたときに、 脂質分子のスパイン内および樹状突起上での広がりを観察する 脂質分子の移動を阻害することで、脂質シグナルが、隣接するシナプスにどのように影響を及ぼすのかを探っていく ＭＩＴ時代には何をやってきたのですか？ クロストークをとめたら連想がとまった。 脂質シグナルをとめたら連想することができなくなった。 個々のシナプスで引き起こされるシグナルは、シナプス内で留まることも予想されるが、近年、一つのスパインの変化が、隣接するスパインに影響を及ぼすことが報告されている 従来までのシナプスでのシグナル伝達を調べる方法としては、シグナル伝達の阻害剤と電気生理的手法を用いた結果が主であり、一万個存在するシナプスの総和から得られた情報である。 How much does enlargement of spine happen? How much does lipid second messenger is there? Is it right to tell lipid signaling as controller of signal? What is the function of septin? Septin is discovered in1971 in budding yeast mutants defective in cell-cycle progression. If you overexpress the septin, not only lipids but also the protein, which localize in membrane, is stopped by the septin, right? I need to prepare the septin, which have mutant ATP binding site or mutant enzyme activity delation mutant. You should learn the mechanism the pathway until producing lipid second messenger. ラフトによって、もっと上流のたんぱく質は動くことがないのではないか？ Ｇたんぱく質はそるブルだから大丈夫。しかし、Ｇｂｒは膜局在型。代謝型グルタミン酸受容体はどのＧたんぱく質を活性化するのか？また、ＰＬＣデルタ、ＰＬＣβは泳ぐが大丈夫か？ 脂質の組成がミックスしないようにたんぱく質がバリアを作っているということは結構ある。らてらるとばそらてらる。 でんどらいとにのみ発現しているようなたんぱく質はないだろうか？ What size is lipid? ゴーシュ型でC-C 1.513; C-H 1.112 Å アンチ型でC-C 1.511C-H 1.112 Å 大体DAGは5Å, 10Å PIP3は10Å, 10Å PTEN, DGKをノックアウトしたらどのくらいまで伸びるのか？ どれくらい脂質は産生するの？ 本当に脂質はシグナルの司令塔なの？ 西塚先生を出す。 デイビッドホロビンを出す。 脂質って細胞膜からどれくらい出ているのか？ＰＩＰ３だったら１５ｎｍ以上は出ていると思う。 もし、始めから脂質の移動が阻害されていたらどうする？ 確かに、CaMkIIはスパインでのみ活性化されることが知られている。 しかし、Rasは結構長く伸びることが知られている。 脂質の移動を阻害するものの有力なものとして、セプチンがあげられるのですが、エンドジーニアスなセプチンもあります。ただ、結構、すべてのスパインネックに存在しているわけではなく、もしかしたら、脂質の移動を変えるような働きをしている可能性があります。クロストークに選択性があるということでとても面白いということになります。 脂質シグナルをスパインで見ることの重要性。 何故、スパインが記憶の最小素子となるのか？ 何故あなたは脂質シグナリングを選んだのか？ 1．脂質シグナルは移動することができるシグナルの最上流である。 2．脂質シグナルの特にＰＩＰ３シグナリングはしばらくの間持続する。 ＰＫＣの局在を見てみるとデンドライトでも起きている。やっぱり脂質は移動していると考えられる。 実は、かれるによって、らすシグナルが閾値の上昇に必要だということがわかっている。しかしながら、何故ラスなのか？実は、ラスはＰＩＰ３の下流なんですよね。 PTENの局在。 DGKの局在。DGKはカルシウムによって活性化されるが、神経細胞でのカルシウムの上昇は瞬時である。 これによって、あるシグナルに反応しやすくなるようになり、ある反応に応答するシナプスクラスターができるのではないだろうか。 シナプスのクロストークに脂質シグナリングが関係していなかったら？ 脂質修飾のメカニズムについて。 ＰＩＰ２の局在は？下の論文にあるように恐らく均一に存在する。 しかし、結局のところ活性化されたグルタミン酸受容体がどこにあるかが重要でさらに、活性化したＰＩ３ＫとＰＬＣがどこにあるかによる。 Neuroscience Letters 423 (2007) 158–161 もしかするとＰＬＣやＰＩ３Ｋがデンドライトまで泳いでいって、ＰＩＰ２を代謝することはないのか？ 恐らくないと思う。その根拠は、代謝型グルタミン酸によって活性化されるＰＩ３Ｋはｐ１１０ｒだと考えられます。 このたんぱく質は、脂質修飾を受けているたんぱく質とコンプレックスを作っている。 もしかしたら他の脂質修飾されていないようなたんぱく質がＰＩＰ３を作る可能性があるかもしれないよ。 そしたら、それは、わかりません。ただ、ここで重要なのは、ＰＩＰ３ができて、それが樹状突起を移っていくことが観察できればいいのだと考えております。 ＰＩ３ｋは１，２，３型が存在する。そのうちＰＩＰ２を基質とするものは、Ｉ型だけである。一般的なＩ型のＡ型は、チロシンリン酸型受容体によって、活性化される。一方、Ｉ型のＢ型は、ｐ１１０γであり、これは、Ｇたんぱく質共役型受容体によって活性化される。Ｂｒとアダプターたんぱく質のｐ１０１と複合体を形成する。このため、かなり移動度が遅いと考えられる。よって、ＰＩＰ３のような低分子の方がかなり早く動けるのではないかと考えております。 よって、ＰＩＰ３の量は、ＰＴＥＮとＰＩ３Ｋのバランスで決まっている。しかし、 ＰＩＰ３を作り出す刺激は、グルタミン酸受容体だけなの？ いえ、恐らく他にもあるとかんがえられます。しかしながら、今回絞っているのはグルタミン酸受容体だけです。 ＤＧＫはどこにいるの？細胞質中にいますが、ＤＧＫは、９つのアイソフォームがあって、α、βは、ＰＳＤ結合ドメインを持っていないが、γ、ζはもっている。基本的に、デンドライトシナプスにいるが、後者は、ＰＳＤに濃縮されている可能性もある。 別にあなたのプローブじゃなくてもサイトゾルプローブで赤と緑比較してできるんじゃないの？ 実は、それでは難しいです。というのは、仮に、フレットプローブと膜局在プローブが培養細胞などで１００％応答した場合どちらも、最高の状態となります。しかし、神経細胞においては、デンドライトと繋がっていますから、さらに、プローブが入ってしまうわけです。すると、膜局在方はこの赤と緑がバックグランドとなって、感度が小さくなってしまうということがあげられます。よって、ＦＲＥＴプローブの方が応答はよいであろうと考えら得ます。 mGluRによって活性化されるPI3Kとして、IB型が挙げられる。これは、Ｇｂｒによって活性化される。 ちなみに、NMDA依存的にＰＩＰ２が減少する系も存在する。これには、２つの可能性が挙げられる。ＰＬＣが泳いでいった。もしくは、樹上突起にも受容体が多少なりとも存在し、それが活性化した。しかし、今調べたいのは、スパインから産生された脂質分子であるから系が全く違うと考えられる。 ＰＩＰ３は、様々な方法で産生されると考えられる。スパインにはチロシンキナーゼ受容体EPH受容体なども存在するだろう。だから、ＰＩＰ３が産生されるメカニズムはたくさんあると考えられる。しかしながら、今回はグルタミン酸受容体を考えているからそれによって活性化されるのは、代謝型グルタミン酸受容体だと考えられる。 もしかすると、ｂｒが移動するかもしれない。しかしながら、脂質とＧたんぱく質どっちが移動が早いかというと、ｇｒの方が大きいから移動しづらいと考えられる。 Rasの活性化は、11microm//4 minである。とても遅い。結局、上流のシグナルがどうなっているかについての情報は何も与えないことになる。 クロストークを行うと何がいいのか？ スパインネックが見えないんだけれどどういうこと？本当にくっついているの？ 何分後に刺激をするの？ どんな点が困難だと考えられるのか？ 逆に、スパインで制限されたらどうするの？ 答。もちろん計画を立てるときには一番面白い作業仮説をたてるわけであります。それはそれで面白いと考えられる。その一つとしてセプチンが上げられます。 普段から脂質はセプチンによって抑えられているんじゃないの？ セプチンは、細胞質のたんぱく質の拡散も防ぐんじゃないの？ それは、ＧＦＰを発現させてホトブリーチすればよい。 それを調べるためには、セプチンＲＦＰを発現させて本当にセプチンが阻害するかを調べればよい。 スパインの大きさってどれくらい？ シナプスのクロストークにプラスマイナスはあるのか？ タイトルはゴシックにする。 申請者の利点はちょっと変えるべき。 何故ＦＲＥＴを使うか？理由を述べる、 脂質シグナルをわからせる １０出たものが拡散してしまうと３になってしまう。それでよいのか？ セプチンの情報 あるセプチンは、ＰＩＰ２などとくっついて膜のbracingを起こす。Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Tanaka-Takiguchi Y, Kinoshita M, Takiguchi K. Curr Biol. 2009 Jan 27;19(2) 140-5. ＤｉＩは分裂溝を通る。 ただ、Ｄｉｌは細胞膜の表面に入ることから表側である可能性が高い。 細胞膜の成分をミックスしないで、そのまま分けるという役割を持っているたんぱく質の一つにセプチンというたんぱく質があります。セプチンは、主に細胞分裂の際に分裂溝にセプチンリングを形成し、細胞分裂に必要なたんぱく質です。また、細胞膜上の成分をミックスしないようにしているからです。 ですので、 スパインのコンパートメントについて カルシウムは、シナプスで制限される。 ＣａＭＫＩＩも同様に制限される。 しかしながら、Ｒａｓたんぱく質は制限されずに、クロストークに必要である、ただ、ラスたんぱく質は、カルシウムシグナリングによって活性化される。ＬＹ PTENの局在について 基本的に、PTEN is preferentially expressed in neurons and is especially evident in Purkinje neurons, olfactory mitral neurons, and large pyramidal neurons. To analyze the function of PTEN in neuronal differentiation シングルセルでは、核と細胞質中に存在することがわかっている。 １．神経細胞には、樹状突起上に約1万個のスパインがあります。人が記憶する前と後で、脳の中で何かが変わっているはずです。実際、このスパインは大きさをダイナミックに変えることから、一つ一つのスパインは記憶の最小単位だと考えられています。故に、個々のシナプスの特徴を知ることは、記憶のメカニズムを探る上でとても重要です。 ２．神経細胞において、脂質シグナルは、記憶のモデルとなるシナプス可塑性と呼ばれる現象に必須であります。脂質シグナルは、シナプス前膜からグルタミン酸が放出されるとシナプス後膜のグルタミン酸受容体が活性化し、ホスファチジルイノシトール４，５２リン酸、（ＰＩＰ２）から（ジアシルグリセロール）ＤＡＧ，ホスファチジルイノシトール３，４，５３リン酸（ＰＩＰ３）が産生されます。これらの脂質は、下流のたんぱく質を制御して、シナプス可塑性を引き起こします。 従来までの脂質の測定法は、破壊分析に頼っていたために、一個一個のシナプスの個性を失っていました。そこで、目的は、脂質シグナルを一つ一つのスパインで観察するということです。 ３．申請者は、現在までに、蛍光共鳴移動ＦＲＥＴプローブ分子を開発しました。CFP, YFP, 脂質結合ドメインをαへリックスで連結します。プローブを膜局在シグナルで細胞膜に連結します。脂質が増えると脂質結合ドメインが結合し、グリシングリシンを中心にプローブが動き、ＣＦＰとＹＦＰが近づきＦＲＥＴが起きます。ＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比から脂質の量を測定しました。培養細胞での脂質のそれぞれの膜での脂質の動態を明らかにしてくることによって、高い評価を得てきました。 ４本研究では、直径１μｍほどの微小空間での脂質の動態を調べることにチャレンジしてみようと考えております。直径１μｍほどの微小空間においては、現在私の用いている蛍光強度比タイプのＦＲＥＴプローブでは、ＹＦＰの光分解が激しく、蛍光強度比が一定しないという短所があります。そこで、蛍光寿命を測るためのプローブ分子に改良を行います。従来のプローブのＣＦＰをＧＦＰにＹＦＰを蛍光を発しないＹＦＰに変えます。蛍光寿命ＦＲＥＴプローブの特徴は、ＧＦＰの蛍光寿命で測定するために、ＧＦＰが光分解したとしても、ただ、蛍光強度がさがるだけで、蛍光寿命は変化しません。図のようにＦＲＥＴが起きたときは蛍光寿命を表す直線の傾きが小さくなります。よって、微小空間でも精度の高いデータを取ることが可能となります。このＦＬＩＭを導入している研究施設は、世界でも３番目、日本ではうちが始めてです。 ５．実験においては、この作製したFLIMプローブを海馬スライスに遺伝子銃によってトランスフェクションします。次に、詳細は省きますが、自作の２光子顕微鏡を用いて、神経細胞を観察します。 ６．次に、プローブを発現した神経細胞の一つ一つのシナプスを刺激します。２００４年に開発された、グルタミン酸アンケイジング法を用います。まず、グルタミン酸前駆体をインキュベートします。一つのシナプスの近傍に光刺激を行うと、この限られた範囲でグルタミン酸が産生され、シナプスが刺激されます。図を観察すると０分で刺激を受けた赤点のスパインが、大きくなっていることがわかります。シナプスはある一定以上の強さの入力を受けることで、このように大きさを変えます。これは、このシナプスがこの入力を記憶したということを示しています。申請先研究室では、このシステムをいち早く取り入れ、８０％以上の確率でシナプスサイズを変えることが可能であります。本研究では、スパインの大きさを変えた際に脂質シグナルがどのように変化するのかを追っていきます。 ７．一年目では、2光子顕微鏡のセットアップを行う。それと同時に、ＰＩＰ２，ＤＡＧ，ＰＩＰ３のプローブ分子をＦＬＩＭプローブに変える。このプローブの特徴は、脂質結合ドメインを変えることによって、様々な脂質を見ることができることです。ＤＡＧのためにＰＫＣＣ１Ｂドメイン、ＰＩＰ３のために、ＧＲＰ１のＰＨドメイン、ＰＩＰ２のためにＰＬＣデルタのＰＨドメインを結合してプローブを作製します。 ２年目では、プローブ分子を発現させます。このプローブは、スパイン、樹状突起の細胞膜に局在します。グルタミン酸産生に伴い、基質であるＰＩＰ２は減少し、ＤＡＧおよびＰＩＰ３は増加すると考えられます。しかしながら、ＤＡＧは破壊分析の結果から一過性、ＰＩＰ３は、持続すると期待できます。よって、空間的には、ＰＩＰ３が樹状突起を移動していくのではないか？と推測します。 ８．３年目は、樹状突起を進展する脂質シグナルが神経細胞の機能にどのように関わっているかを調べようと思っています。脂質シグナルは、隣接するスパインにも及ぶと考えられますから、何か、隣接するシナプスに影響を与えるのではないかと考えられシナプス間のクロストークなどを調べることがきるのではないかと考えます。例えば、近いスパインでは、遠いスパインに比べて、シナプス構造可塑性を引き起こすための、刺激の閾値が下がると期待できます。この際、樹状突起上に脂質の移動を阻害するようなたんぱく質を仕込むことで本当に脂質が関与しているかを調べようと考えております。 ９．この研究において期待できること 現在、シナプスの入力へのパターンはわかっていません。クロストークが起きれば、Ａいう入力やＢという入力に対して、あるシナプスのクラスターができると考えられます。２００７年にやっと、ラスたんぱく質のシグナリングがシナプス間のクロストークに関係することがわかるようになってきました。しかし、まだあまりにもわかっていることが少なすぎます。私の脂質の動態を明らかにすることで、脂質シグナルとシナプス間のクロストークの関係を明らかにし、記憶の基盤となる神経回路のパターンの解明を行う。 １０． ＰＩＰ３シグナリングは、１時間以上も続いているということ。これは、高頻度の電気刺激をおこなっってシナプス可塑性を誘導したときに、ＰＩＰ３産生酵素ＰＩ３Ｋの阻害剤であるＬＹ２９を加えたときに、シナプス可塑性が阻害されるということからわかります。よって、脂質の速報拡散は、０．５μｍ・秒なので、十分に樹状突起を移動することができるということ。ラスたんぱく質のシグナルが樹状突起を介して隣のシナプスに移動し、スパインのシナプス可塑性の閾値を下げるということは報告されています。もちろん、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置しているわけですから、脂質シグナルがどのようにラスたんぱく質を制御しているかを調べることは興味深いと考えられます。 もう少し、クロストークの背景を教えてください。 ＮＯやエンカンナビノイドなどについても含めて。 ＮＯやエンカンナビノイドのクロストークは、ＮＯやエンカンナビノイドが膜を超えることができて、これがシナプス前膜に作用して、隣接するシナプスへ影響を与えるというものであります。しかし、これらの研究は、専ら、電気生理学で行われており、本当に、隣接するスパインでのクロストークを見ているかについては全く、わかっておりません。 このように、シナプス前膜に作用するわけですが、シナプスのクロストークは何も前膜だけでなくて、シナプス後膜スパインで起きていてもよいわけです。近年、２００８年にすぼぼだ博士が始めてＲａｓシグナルが関与しているということを示しました。興味深いことにラスと脂質シグナルは結びついている。よって、脂質シグナルも何か関係があるのではないかと期待しております。 一つのスパインを調べることそんなに必要なの？ 大事です。そもそも脳を研究する究極の目的は、脳を完全に理解することです。理解することができれば、それをターゲットとした薬も作ることができる。しかし、現在、記憶を担う記憶の回路については、ほとんどブラックボックスなのです。いきなり難しいことはできない。記憶の最小単位のシナプスがどのような回路パターンで振舞っているのかを調べることができれば、次の高次構造を調べることができる。さらに、神経細胞レベルで調べることができれば、もっと、神経同士のクロストークを調べることができます。だから、スパインでのいろいろな角度からの情報がほしいのです。だから調べることは意義があります。 クラスター化することってそんなに大事なの？ これから調べるのでなんとも言えませんが、大事だと考えられます。 これは、ちょっと、大胆な仮説でありますが、例えばりんごという情報を記憶したとする。その時、周りのスパインにも影響を及ぼします。これによって、りんごに付随する情報、赤い、おいしいなどのものを近傍に入力しやすくします。すると、今度思い出すとき、神経回路にとって効率よく思い出すことができる。そのようなことを念頭に考えております。 このためには、例えば、これに脂質シグナルが関与するかを調べるためには、脂質シグナルを樹状突起上で阻害するような、マウスを作ってやって行動解析を行うことによって何か情報が得られるのではないか？もし、この実験でうまくいけば、そのようなことも可能だと考えられます。 カレルのパクリじゃないの？ Ｒａｓシグナリングは、１０マイクロメートル。ねいちゃーのやつも１０マイクロメートル。 病気と脂質シグナルの関係は？ 最近、報告された例は、２００８年にアルツハイマー病に関与するＡｂたんぱく質を皮質一時神経細胞に加えるとＰＩＰ２の量を減らすことが報告された。これは、カルシウム依存的で、しなぷとじゃにんを発現していないラットでは、ＰＩＰ２の起きないことがわかっている。よって、Ａｂの影響は、しなぷとじゃにんを介してＰＩＰ２を減らすことで神経細胞の不全を起こしているのではないか？と考えています。ダウンシンドロームのモデルマウスでＰＩＰ２の量が減っているということも知られております。また、加齢マウスでは、ＰＩＰ２の量が減っていることが知られて、ＰＩＰ２の原料となる脂肪酸を加えるとＰＩＰ２が増えてさらにシナプス可塑性があがることが知られています。また、PIP3シグナルの下流のGSKたんぱく質が、加齢における記憶の再固定に関わっていることが、ノックアウトマウスを使った実験から明らかになっている。 ＦＬＩＭに最低限必要なこととは？ １．８０ＭＨｚのパルスレーザー ２．高感度の光電子増倍管 ３．ナノ秒オーダーで蛍光寿命を取得するハードウェア 蛍光寿命についてもう少し詳しく教えてください。 蛍光体が励起光を受けると励起状態になります。ここでの滞在時間が蛍光寿命です。励起光が基の準位に戻るときには、３つの過程でもどります。発光遷移（光）、無放射遷移（熱）、蛍光共鳴エネルギー移動です。ここにあくせぷたーがあると、Ｓ１状態での蛍光体の滞在時間が短くなる。よって、蛍光寿命を表す減衰曲線が短くなります。 やることたくさんあるけれど、現実可能なのか？ やるべきことの重要なポイントとしては。 １．２光子顕微鏡のセットアップ。およびグルタミン酸アンケイジングシステム。これは、ＭＩＴ時代に習いましたので、単純に組み立てるだけです。 ２．ＦＬＩＭのセットアップ。これも、脂質プローブではありませんが、すでに、ＦＬＩＭを取るためのノウハウはありますので、あとは、組み立てるだけです。 ３．プローブ作りおよびその改良は、１年目で行えます。 ４．一度、このようにＦＬＩＭが取れる設備が完了すれば、後は、とるだけですのでどのように研究を進めるかというアイディア勝負になると思います。ですので、多くは見えますが、１年あればセットアップはできます。 俺は、こうじゃなくてもいいんじゃない？という質問に弱い。 あと、今まで、考えたことがないようなことを聞かれると弱い。 だけど、これに関しては誰でも一緒。 次に、脂質の移動を止めるために、セプチンたんぱく質を強制発現します。発現します。このたんぱく質は、図のようにスパインネックに発現します。緑がＧＦＰセプチン、赤は神経細胞の形状のマーカーです。セプチンは３ｎｍほどのたんぱく質でこれらがオリゴマーを形成し、スパイン脂質の移動を阻害します。この状態で、一つのシナプスを刺激します。すると脂質の移動は阻害されますから、隣接するスパインの大きさの変わり方は、遠くのシナプスと変わらないのではないかと推測できます。 この実験によって、脂質シグナルがシナプスのクロストークに必要であるかを検証します。 ジーンがんの効率 これは、ばいおらっどとも話したのですが、まず、金粒子が入る確率および発現効率とも調べてないからわかっていないようです。そして、金が入ることによって、死んでしまう細胞も中にはあるかもしれないです。うまい具合に入ったものだけが光る。選択性は多少あります。しかし、この理由はわかりません。入った細胞だけが変なんじゃないの？その可能性は１００％否定できるわけではありません。しかし、２つあって、一つは、われわれの用いているシナプス構造可塑性に関しては、問題がないこと。また、他の研究者もこれ以外に遺伝子を導入する方法はなく、これを使っていること。入った細胞だけ大きさが変わっているんじゃないの？実はというと、電顕でアンケイジングしたスパインを見たものがあります。やはり変わっていました。 それって、ＭＩＴでやったことでしょ？そういうの出しちゃだめだよ。 ２光子顕微鏡のメリットは？共焦点との違いは？ 励起光が違う。 中まで到達することができる。紫外光による細胞ダメージはない。 ただ、スライスの表面などでは、共焦点でも細胞体は見ることが可能である。 ただ、ゆくゆくはねずみの頭などで行うには、共焦点では明らかに見えません。この理由は赤外光だから ２光子顕微鏡の分解能は、共焦点と同じくらいで200-300 nmくらい？ しかし、ｚ軸分解能はとても悪くなる。 また、実際には、うちのシステムは、共焦点ではできません。というのは、あんけいじんぐは、光分解を一点で行う必要があります。共焦点では、できない。 脂質とプローブの関係はどうなっているのか？ 普通培養細胞は、１ｐｌくらいだと考えられています。 スパインの中は０．１ｆｌから０．０１ｆｌくらい 大体、１００倍くらいだと考えられます。 大体、ＤＡＧは、１ｆモルです。一細胞に。 だから、１０あぷとモルくらいある。 ＰＩＰ３の場合は、その１００倍くらい少ないから。１００ゼプト盛るくらいあります。これが、刺激によって１０倍くらいに変わるといわれています。 脂質プローブと脂質の結合能は、かなり高いですから、始めから結合していると考えられます。ここで、刺激が加わると、破壊分析の結果などを参考にしますと１０倍から最大で５０倍くらいの脂質ができます。これに、プローブが反応して応答するということになります。これは、プローブ全部を応答させるための量く らいできます。 ＦＬＩＭについてもう少し教えて？ ＦＬＩＭのメリットは？他にないの？ 蛍光強度比フレットだと、ＹＦＰのスペクトルが漏れて、ＹＦＰも励起してしまう。あと、ＹＦＰの蛍光のＣＦＰへの漏れこみも問題になってくる。 しかし、ＦＬＩＭでは、ＹＦＰが消えているので問題ない。 現在は、場所をきちんと記憶できるようなステージがあるので、これを用いてシナプスの場所を特定して、アンケイジングを行って免疫染色を行うというのは不可能なのか？ 答え。ポイントは、リアルタイムでとることができないということになるでしょう。２番目には、刺激前と後で比較を行うことができないということです。 あなたのプローブ本当にそのように働いているの？ 例えば、グリシングリシンを除くとうまく働かなくなる。また、脂質局在ドメインを除いた細胞質プローブではうまくいかないなどの点から、確かに、このプローブのポイントとなるところがきちんと働いて脂質を検出していると考えられます。 現在、FLIMを行っている人の研究者はどれくらいいるの？ 神経細胞ということで、ＦＬＩＭの論文を出しているというところになると、３人ほど思い出します。一人目はハーバードのＭＧＨで、アルツハイマー病のマウスやラットにおいて、カルシウムシグナルがどのように変化しているかを調べているぶらいあんばくすかい博士。しかし、この研究はシナプスではなく主に細胞体で調べております。次に、スパインレベルであると、かなり少なくて、かれるすぽぽだと、やすだりょうへい博士です。やすだ博士はかれるのぽすどくでした。近年、ＭＩＴ時に林研で作製したＣａＭｋＩＩプローブをＦＬＩＭに改良してＣａＭｋＩＩの活性を調べて高い評価を受けたことは記憶に新しいです。 脂質の動態ということになると、培養細胞レベルでは、京都の松田先生が、私たちのプローブを用いて脂質の動態を観察しております。斉藤尚明先生がＰＫＣの活性化を調べております。 Ｒｏバリューはどれくらい。５０から６０Åくらい。 ２光子と共焦点の違い 実際、共焦点でもスライスくらいだったら神経細胞体のカルシウムイメージングなどは可能である。 今まで、細胞質タイプのプローブで見られていると思うけれどあれじゃだめなの？ はい、まず大前提にあるのは、細胞質タイプのプローブで調べられているのは、神経細胞全体を刺激しているということ。そうすると、全体が刺激されるので、プローブの局在をみることができます。しかしながら、一点でグルタミン酸刺激を行うと、細胞質タイプでは見ることができません。何故かと言うとポイントは、バックグラウンドです。 どのくらいの長さイメージングするの？シナプス構造可塑性の実験では、大体一時間くらい。ですので、一時間くらい観察しようと考えております。 プローブの局在はどうなるの？私のプローブ分子には、Ｎ－ｒａｓの脂質修飾ドメインがついております。スパインおよび樹状突起です。 メカニズムは？ファルネシル基で小胞体に結合し、パルミトイル基で細胞膜に結合します。 昔の研究のぽいんとは？ 私のプローブ分子の特徴は、２点あります。 それによって、図で示す。 透明ＹＦＰの原理？ 蛍光は、蛍光体が高い順位から低い順位に移るときに起きます。 その際に、発光遷移のほかに、２つ影響を受けるものがあります。 一つは、無放射遷移、これは、熱によるもの。 ２つめは、蛍光共鳴エネルギー移動。 透明なＹＦＰの場合は、この無放射遷移で起きています。 この研究で困難だと思われるところはどこでしょうか？ カルシウムシグナリングとの関係は？ カルシウムによって、ＣａＭＫＩＩなどが活性化しシナプス可塑性を誘導します。阻害剤を加えた実験から、カルシウムシグナリングも脂質シグナルもどちらも、シナプス可塑性に重要であることがわかっています。しかしながら、カルシウムシグナリングは、スパインで留まることが知られています。よって、シナプスのクロストークはむしろ代謝型グルタミン酸受容体が関与しているのではないかと考えております。しかしながら、グルタミン酸受容体の下流の脂質シグナルは、カルシウムシグナリングに比べてほとんどわかっておりません。よって、調べるために意義のあることだと考えます。 岡本さんのＦＲＥＴの図と安田さんの図 これすべて、すでにできているんじゃない？ 簡単にできるんじゃないの？ 確かに、２光子顕微鏡のセットアップ、アンケイジングシステムのセットアップ、ＦＬＩＭの測定のノウハウは知っていますが、実際組み立てるのはかなり時間がかかります。あっという間に１年かかります。逆に言うとそれくらいじゃないと３年間では終わりません。 他に、どんなＦＲＥＴプローブを作ったら面白いの？ ＦＬＩＭは本当に高感度か？ シナプス可塑性ってどうやって測るの？ ＭＩＴ時代には何をやってきたのですか？ 大きく分けて３つあります。２行使顕微鏡のセットアップのノウハウ。アンケイジング法のノウハウ。ＦＬＩＭの測定のノウハウ。実際、私、昔脂質の研究を行っていまして、脳という新しい分野に挑戦するに当たって、脳のことほとんど知らなかったので、しかも、初めての海外ということで言葉は通じないし、林先生に朝から晩まで働かされるし、本当に大変でした。 ＦＬＩＭとかだしちゃっておかしくない？書いてないよ？ ２点ありまして、１点目は、申請書に書ききれなかったということ。 ２点目は、私は、常に面白いアイディアを考えております。よって、面白いものがあれば、どんどんアップデートをしていきます。 何か、脂質シグナルがシナプスのクロストークに関係しているという証拠はあるの？ 確定的な証拠はありません。間接的な証拠としましては、ＰＩＰ３シグナリングは、１時間以上も続いているということ。これは、高頻度の電気刺激をおこなっってシナプス可塑性を誘導したときに、ＰＩＰ３産生酵素ＰＩ３Ｋの阻害剤であるＬＹ２９を加えたときに、シナプス可塑性が阻害されるということからわかります。よって、脂質の速報拡散は、０．５μｍ・秒なので、十分に樹状突起を移動することができるということ。ラスたんぱく質のシグナルが樹状突起を介して隣のシナプスに移動し、スパインのシナプス可塑性の閾値を下げるということは報告されています。もちろん、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置しているわけですから、脂質シグナルがどのようにラスたんぱく質を制御しているかを調べることは興味深いと考えられます。 では、他に何か面白いテーマはないの？ 確かに、ＰＩＰ２は、シナプス前膜で調べられているので、ベシクル小胞が放出する際に、このプローブをシナプス前膜に導入しておいてどのような時に産生しているのかということを調べることは重要です。それよりも、私が興味を持っているところは、シナプス構造可塑性、つまり、シナプスが大きくなるときに、劇的に脂質の量が増えているわけです。短期間でのこの脂質の増加は、ちょっと信じられません。例えば、細胞分裂は５時間ほどをかけて１つが２つになるわけですが、この可塑性に関しては、１分以内に２倍以上になるわけです。この時、とんでもなく脂質代謝が動いていると想像できます。そのパスは２つあって、１つは、細胞膜で激しく脂質産生酵素が動いていること。もう一つは、トランスゴルジなどから激しく膜輸送が起きること。どちらかを調べることはとても面白いと考えております。 私は、常に、よくなるように考えております。ですので実験がよいと思えば変えます。本筋は外れておりません。 従来までのグルタミン酸を放出する方法。 バスアプリケーション。マイクロパフ。電気刺激 刺激はどのようにやっているの？ ０．５Ｈｚ．２ｍｓ、１Ｈｚなど。とにかく電気生理でシナプス可塑性が起きていれば大丈夫。 クロストークをとめたら連想がとまった。 脂質シグナルをとめたら連想することができなくなった。 How much does enlargement of spine happen? How much does lipid second messenger is there? Is it right to tell lipid signaling as controller of signal? What is the function of septin? Septin is discovered in1971 in budding yeast mutants defective in cell-cycle progression. If you overexpress the septin, not only lipids but also the protein, which localize in membrane, is stopped by the septin, right? I need to prepare the septin, which have mutant ATP binding site or mutant enzyme activity delation mutant. You should learn the mechanism the pathway until producing lipid second messenger. ラフトによって、もっと上流のたんぱく質は動くことがないのではないか？ Ｇたんぱく質はそるブルだから大丈夫。しかし、Ｇｂｒは膜局在型。代謝型グルタミン酸受容体はどのＧたんぱく質を活性化するのか？また、ＰＬＣデルタ、ＰＬＣβは泳ぐが大丈夫か？ ラフトとＰＩＰ３の関係は？ 確かに、ラフトみたいなところでできますが、物理的な面から言うと、ラフトは、比較的飽和脂肪酸を足に持った脂質がいるところです。ＰＩＰ３，ＤＡＧの足は、ステロイルアラキドノイルなので、ラフトをでることはあながちおかしくないと考えられます。 脂質の組成がミックスしないようにたんぱく質がバリアを作っているということは結構ある。らてらるとばそらてらる。 でんどらいとにのみ発現しているようなたんぱく質はないだろうか？ What size is lipid? ゴーシュ型でC-C 1.513; C-H 1.112 Å アンチ型でC-C 1.511C-H 1.112 Å 大体DAGは5Å, 10Å PIP3は10Å, 10Å PTEN, DGKをノックアウトしたらどのくらいまで伸びるのか？ 本当に脂質はシグナルの司令塔なの？ 西塚先生を出す。 デイビッドホロビンを出す。 脂質って細胞膜からどれくらい出ているのか？ＰＩＰ３だったら１５ｎｍ以上は出ていると思う。 もし、始めから脂質の移動が阻害されていたらどうする？ 確かに、CaMkIIはスパインでのみ活性化されることが知られている。 しかし、Rasは結構長く伸びることが知られている。 脂質の移動を阻害するものの有力なものとして、セプチンがあげられるのですが、エンドジーニアスなセプチンもあります。ただ、結構、すべてのスパインネックに存在しているわけではなく、もしかしたら、脂質の移動を変えるような働きをしている可能性があります。クロストークに選択性があるということでとても面白いということになります。 脂質シグナルをスパインで見ることの重要性。 ２光子顕微鏡のメリットとは？ 共焦点でも、スライスでも見えるんじゃないの？ 別に、２光子顕微鏡で見なくてもいいんじゃないの？ 何故あなたは脂質シグナリングを選んだのか？ 1．脂質シグナルは移動することができるシグナルの最上流である。 2．脂質シグナルの特にＰＩＰ３シグナリングはしばらくの間持続する。 ＰＫＣの局在を見てみるとデンドライトでも起きている。やっぱり脂質は移動していると考えられる。 実は、かれるによって、らすシグナルが閾値の上昇に必要だということがわかっている。しかしながら、何故ラスなのか？実は、ラスはＰＩＰ３の下流なんですよね。 PTENの局在。 DGKの局在。DGKはカルシウムによって活性化されるが、神経細胞でのカルシウムの上昇は瞬時である。 これによって、あるシグナルに反応しやすくなるようになり、ある反応に応答するシナプスクラスターができるのではないだろうか。 シナプスのクロストークに脂質シグナリングが関係していなかったら？ 脂質修飾のメカニズムについて。 ＰＩＰ２の局在は？下の論文にあるように恐らく均一に存在する。 しかし、結局のところ活性化されたグルタミン酸受容体がどこにあるかが重要でさらに、活性化したＰＩ３ＫとＰＬＣがどこにあるかによる。 Neuroscience Letters 423 (2007) 158–161 もしかするとＰＬＣやＰＩ３Ｋがデンドライトまで泳いでいって、ＰＩＰ２を代謝することはないのか？ 恐らくないと思う。その根拠は、代謝型グルタミン酸によって活性化されるＰＩ３Ｋはｐ１１０ｒだと考えられます。 このたんぱく質は、脂質修飾を受けているたんぱく質とコンプレックスを作っている。 もしかしたら他の脂質修飾されていないようなたんぱく質がＰＩＰ３を作る可能性があるかもしれないよ。 そしたら、それは、わかりません。ただ、ここで重要なのは、ＰＩＰ３ができて、それが樹状突起を移っていくことが観察できればいいのだと考えております。 ＰＩ３ｋは１，２，３型が存在する。そのうちＰＩＰ２を基質とするものは、Ｉ型だけである。一般的なＩ型のＡ型は、チロシンリン酸型受容体によって、活性化される。一方、Ｉ型のＢ型は、ｐ１１０γであり、これは、Ｇたんぱく質共役型受容体によって活性化される。Ｂｒとアダプターたんぱく質のｐ１０１と複合体を形成する。このため、かなり移動度が遅いと考えられる。よって、ＰＩＰ３のような低分子の方がかなり早く動けるのではないかと考えております。 よって、ＰＩＰ３の量は、ＰＴＥＮとＰＩ３Ｋのバランスで決まっている。しかし、 ＰＩＰ３を作り出す刺激は、グルタミン酸受容体だけなの？ いえ、恐らく他にもあるとかんがえられます。しかしながら、今回絞っているのはグルタミン酸受容体だけです。 ＤＧＫはどこにいるの？細胞質中にいますが、ＤＧＫは、９つのアイソフォームがあって、α、βは、ＰＳＤ結合ドメインを持っていないが、γ、ζはもっている。基本的に、デンドライトシナプスにいるが、後者は、ＰＳＤに濃縮されている可能性もある。 別にあなたのプローブじゃなくてもサイトゾルプローブで赤と緑比較してできるんじゃないの？ 実は、それでは難しいです。というのは、仮に、フレットプローブと膜局在プローブが培養細胞などで１００％応答した場合どちらも、最高の状態となります。しかし、神経細胞においては、デンドライトと繋がっていますから、さらに、プローブが入ってしまうわけです。すると、膜局在方はこの赤と緑がバックグランドとなって、感度が小さくなってしまうということがあげられます。よって、ＦＲＥＴプローブの方が応答はよいであろうと考えら得ます。 mGluRによって活性化されるPI3Kとして、IB型が挙げられる。これは、Ｇｂｒによって活性化される。 ちなみに、NMDA依存的にＰＩＰ２が減少する系も存在する。これには、２つの可能性が挙げられる。ＰＬＣが泳いでいった。もしくは、樹上突起にも受容体が多少なりとも存在し、それが活性化した。しかし、今調べたいのは、スパインから産生された脂質分子であるから系が全く違うと考えられる。 ＰＩＰ３は、様々な方法で産生されると考えられる。スパインにはチロシンキナーゼ受容体EPH受容体なども存在するだろう。だから、ＰＩＰ３が産生されるメカニズムはたくさんあると考えられる。しかしながら、今回はグルタミン酸受容体を考えているからそれによって活性化されるのは、代謝型グルタミン酸受容体だと考えられる。 もしかすると、ｂｒが移動するかもしれない。しかしながら、脂質とＧたんぱく質どっちが移動が早いかというと、ｇｒの方が大きいから移動しづらいと考えられる。 Rasの活性化は、11microm//4 minである。とても遅い。結局、上流のシグナルがどうなっているかについての情報は何も与えないことになる。 クロストークを行うと何がいいのか？ スパインネックが見えないんだけれどどういうこと？本当にくっついているの？ 何分後に刺激をするの？ どんな点が困難だと考えられるのか？ 逆に、スパインで制限されたらどうするの？ 答。もちろん計画を立てるときには一番面白い作業仮説をたてるわけであります。それはそれで面白いと考えられる。その一つとしてセプチンが上げられます。 普段から脂質はセプチンによって抑えられているんじゃないの？ セプチンは、細胞質のたんぱく質の拡散も防ぐんじゃないの？ それは、ＧＦＰを発現させてホトブリーチすればよい。 それを調べるためには、セプチンＲＦＰを発現させて本当にセプチンが阻害するかを調べればよい。 スパインの大きさってどれくらい？ シナプスのクロストークにプラスマイナスはあるのか？ タイトルはゴシックにする。 申請者の利点はちょっと変えるべき。 何故ＦＲＥＴを使うか？理由を述べる、 脂質シグナルをわからせる １０出たものが拡散してしまうと３になってしまう。それでよいのか？ セプチンの情報 あるセプチンは、ＰＩＰ２などとくっついて膜のbracingを起こす。Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Tanaka-Takiguchi Y, Kinoshita M, Takiguchi K. Curr Biol. 2009 Jan 27;19(2) 140-5. ＤｉＩは分裂溝を通る。 ただ、Ｄｉｌは細胞膜の表面に入ることから表側である可能性が高い。 細胞膜の成分をミックスしないで、そのまま分けるという役割を持っているたんぱく質の一つにセプチンというたんぱく質があります。セプチンは、主に細胞分裂の際に分裂溝にセプチンリングを形成し、細胞分裂に必要なたんぱく質です。また、細胞膜上の成分をミックスしないようにしているからです。 ですので、 スパインのコンパートメントについて カルシウムは、シナプスで制限される。 ＣａＭＫＩＩも同様に制限される。 しかしながら、Ｒａｓたんぱく質は制限されずに、クロストークに必要である、ただ、ラスたんぱく質は、カルシウムシグナリングによって活性化される。ＬＹ PTENの局在について 基本的に、PTEN is preferentially expressed in neurons and is especially evident in Purkinje neurons, olfactory mitral neurons, and large pyramidal neurons. To analyze the function of PTEN in neuronal differentiation シングルセルでは、核と細胞質中に存在することがわかっている。 一人目の先生が、免疫染色でＰＩＰ３の進展は確認されているの？という質問をしてきた。俺は、前に佐々木とそのことについて話していたにも関わらず、うまく説明することができなかった。結局、リアルタイムで取れることが大事だという風に言ってしまったが、そうじゃない。本当の答えは、シナプス構造可塑性を起こしたスパインを、一度視野からはずして、免疫染色して見るというのは極めて不可能に近いということである。そのように答えないと正解とはいえない。今考えてみると、ちょっと、彼も不思議そうな顔をしていた。
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