約 2,899,375 件
https://w.atwiki.jp/varutorie/pages/42.html
概要 本多技研――ホンダ技術研究所に勤務するエンジニア。 新型の軍用蒸気魔導ゴーレム「ASIMO-V」およびその転送装置の試験官でもある。 972年冬生まれ。男性。 5歳の時に現皇帝が即位し、以後急速に発展する帝都の中で育った、いわゆる新帝国第一世代。 平民出身ながら帝都大学のOBで、専攻は魔導情報工学。在学中、『存在情報の不確定性を利用した情報通信による物質転送システムの可能性について』という論文を書き上げたことで修士号まで取得している。 その他、機械工学や軍事学（特に戦史、戦術）についての造詣も深い。 もともと軍人になるつもりはなく、工学系の技術者として生きることを希望していたのだが、大学在学中から親交のあったドワーフの鍛冶師ゾーロト・モーロトの手になる（正確には「門」から流入した異世界の狙撃銃を彼が再設計した）狙撃用ライフル、その名も「モロトフ狙撃銃」のテストユーザーとなったことから軍関係者の目に留まり、軍属としてのスカウトを受けることに。 あくまでスカウトであって強制入隊などではないのだが、ヒラの技術者として相応の安月給しかもらっていない身からすると、その雇用報酬はあまりに……。 交友関係 （他陣営も含めて幅広い交友関係を持つが、ここでは特に親しい者について記載する） 雲水技術試験隊のジョグとは、同系列の組織で働く同僚ということもあって親しくしている。 リルムの娘・メルルードやアムネオラとは何かとウマが合うようだ。 ただし異性としてではなく、くだらない冗談を言い合う悪友、つまり男友達のような関係に近い。 一方でネツァクや五十土のことは比較的落ち着いた（？）話し相手として認識している。 エチュードの創造したトークン・ドナドや、妖精ジルのことがお気に入り。 秘書（アルバイト）として雇っているアルテに対しては曖昧な感情を持て余し気味……？
https://w.atwiki.jp/nm_7/pages/66.html
JOURNEYツアーでの締め曲に起用された奈々さんの秘蔵っ子 ライブでの盛り上がりはハンパなく、今後も数多く歌われる予感 リウムの色はきらめくBlue一択 FCイベントのMV撮影では青が指定（それ以外の色は禁止）された経緯もあるので、強く青を推奨します イントロ 出だし16秒のところで演奏に合わせて一度大ジャンプ（奈々さんも合図してくれる） そのあとは演奏と奈々さんの煽りに合わせて連続ジャンプ Aメロ 特になし Bメロ 警報からのPPPHのあと、きらめく（FUFU～）Blueは（FUFU～） サビ YES！のところはコールをかぶせながらジャンプ DIVING！×3のところはコールをかぶせながらビングに合わせてジャンプ Are you ok?は自分ら担当。最近は奈々さんもこちらにマイクを向けてくる コーラスの「今すぐ～」も自分ら担当 間奏 演奏と煽りに合わせて連続ジャンプ Aメロ 「上手く」のあとで演奏に合わせて掛け声とジャンプ Bメロ 警報からのPPPHのあと、もっともっと（FUFU～）素直になろう（FUFU～） サビ YES！のところはコールをかぶせながらジャンプ Gliding！×3のところはコールをかぶせながらディングに合わせてジャンプ Are you ok?は自分ら担当。最近は奈々さんもこちらにマイクを向けてくる コーラスの「存在～」も自分ら担当 間奏 演奏と煽りに（ｒｙ Cメロ 特になし サビ YES！のところはコールをかぶせながらジャンプ DIVING！×3のところはコールをかぶせながらビングに合わせてジャンプ Are you ok?は自分ら担当。最近は奈々さんもこちらにマイクを向けてくる コーラスの「今すぐ～」も自分ら担当 締め 演奏と（ｒｙ コメントテスト -- 管理人 (2011-10-23 15 59 06) 名前 コメント
https://w.atwiki.jp/hiding_gm/pages/156.html
ジョー コール 目次 目次 パーソナル・データ2005-2006 使用感甲 乙 丙 圏外 パーソナル・データ 2005-2006 カード番号： 23 所属クラブ： チェルシー 背番号： 10 ポジション： MF 生年月日： 1981/11/8 身長： 175cm 体重： 70kg 国籍： イングランド スキル： ブロンデルの唄 OF DF TC PW SP ST -- LS LM CT RM RS FW MF DF 16 9 18 10 16 14 83 △ △ △ ◎ ◎ 45 43 12 使用感 甲 乙 05-06右WGで使用しています。最初は潰されがちですが経験がたまるにつれてスルスルと抜いて行きます。ドログバ，ランパードと黄金連携になった後はさらにすごくなりました。切れ込んでいってのシュートもなかなかの決定力です。 丙 圏外
https://w.atwiki.jp/ikeuchi-lab/pages/5.html
機器 デジタルカメラ(池内研) CANON EOS X4＋単焦点マクロ50mm＋保護フィルター ゲル写真：Av絞り優先オートモード、F14より暗くする、ISO=100画質最大 プレート写真：Av絞り優先オートモード、F14より暗くする、ISO=100画質最大、ホワイトバランス調整が必要 ホワイトバランス調整：１．基準の背景を撮影→２．MENUボタン･左上→左２つ目アイコン=露出補正など→３．上下選択ボタンでMWB画像選択を選択→４．SETボタン→５．画像を表示→６．左右選択ボタンで基準画像を表示→７．その画像を選択=SETボタン→８．「使用します」=OKを選択→９．SETボタン→MENUボタンで、撮影モードに戻る。 撮影時のマニュアルホワイトバランス選定：１．リングボタンのWBを押す→２．マニュアルWB(画面右端)を選択→３．SETボタン オートクレーブ(共通) 開けていいときは○、駄目なときは×。回数を書いて10回になったら洗う。 ゴミ用は5回 蒸気漏れがあっても、圧力、温度が下がるまで、絶対に開いてはいけない。開くと、大やけどのおそれあり プレート 使用後は溜めておき、みんなでゲルを剥がしてオートクレープ→地下ゴミ置 き場(要カギ) 分光光度計(UV-2400PC) 透明なサンプルの測定に適、細胞の吸収スペクトル測定には不適 セルは下部が凹んでるのがたまにあるので注意 分光光度計(U-3500) 細胞の吸収スペクトル測定に適→プロトコル参照 FMBIO FMBIO用の板にサンプル乗せて、輪ゴムなど目印も置いておく→POWER ON(スイッ チはカバーの中にある)→PC Acrylamide→範囲を適当に選んでPreRead→範囲 を選んでRead(5分ぐらいかかる)→TIF形式で保存 出力が8bitTIF形式なのでPhotoshopでBMPなどにコンバートしておく 液体窒素 カード・液体窒素容器 容器を置く(1)後はカード・スイッチを順番に。容器置き場に乗らないように 注意 左にあるスイッチとタイマーで管の排気が出来るが、うるさい。 綿ろ管 目盛アリは目盛が消えかけてないか確認し、シリコ栓してオートクレープ 目盛ナシは管と青梅綿を詰めて150℃ 4h 綿ろ管洗浄 中身はシアノ用廃液に。綿栓を捨ててオートクレープして洗う シアノ用廃液は溜まったらアルミでフタをしてオートクレープして捨てる チップ捨て チップをオートクレープ→カギB27。16号館B1ゴミ捨て室でクリップ付けてか ごに入れる、排水閉める、水入れて60分で運転→60℃インキュベーターで乾燥 →ハコへ CBB廃液 NaOH35gで大体中和。pH試験紙で確認して捨てる pHメータ MANU→安定するまで待つ→READ STANDBYサンプルが乗るように二本のスタンダードで調整する NORで大まかな値 EXPでDISPLACE基準の細かい範囲に 校正は中性に近い側をASYMMで、遠い方をSENSで微調節 フレンチプレス 3号館鍵・試料・100%EtOH・MilliQ3号館2階の低温室に一式があり、油圧ポンプは実習準備室にある 3回ぐらい繰り返す。途中でシリンダーを氷冷する。 シリンダーにピストンを、一番下の目盛まで差し込み、ホルダーに掛けてお く サンプルをシリンダーに入れ、密閉プラグの大きい方の穴に円錐弁を尖った 方を先にして入れ、そこに流量調節バルブを差して閉める チューブを小さい方の穴に取り付ける 密閉プラグをシリンダーに取り付ける流量調節バルブを少し緩めておくと空気が抜けて差し込みやすい プレス台に、シリンダーが上になるように乗せて、シリンダーの上にキャッ プを乗せる 板(工具箱)を用いて流量調節プラグをきつく締める 油圧ポンプをON Pressure controlを開いた状態(尤も左)でUP 台が上がりきったらPressure controlを閉めていき、1600kg/mにする 板(工具箱)で少しずつ流量調整バルブを緩めながらPressure controlを閉め ていく。1600kg/mを保ちつつ、一定の速度でピストンが動くようにす る ピストンが最後まで行くと圧力が0になるのでPressure controlを開ける ブザーが鳴ったらBuzzer resetで止めておく 開ける時は密閉プラグの二カ所の穴から破砕液が飛び出てくる事がよくある ので注意 終わったら洗ってMilliQ - 100%EtOHでwash。使用記録を書く dry up 共通室に装置がある。フタを開けたままエッペンをセットしてPOWER ON - コックを奥に90度 五分ぐらい 終わったらコックを手前に戻す - POWER OFF DDW DIWの管をタンクに→DIW→水量チェック(SetQで水量変更,DIWで確定)→DIW→ 記録をつける MilliQ PUMP ON→量を指定してSTART→PUMP OFF→記録をつける CO2ボンベの交換 ボンベ置き場に持って行き交換。レンチは培養室 プロトコル BG11 ( NaNO1.5g/L MgSO75mg/L KHPO39mg/L CaCl・2HO 38mg/L NaCO20mg/L Citric acid・HO 6mg/L Ferric ammonium citrate 6mg/L NaEDTA 1mg/L A6 (microcomponent) 1mL/L Stock Solution 1 Citric acid 0.3g Ferric ammonium citrate 0.3g Na sub(2)EDTA 0.5g DDW up to 100mL Stock Solution 2 NaNO sub(3) 30g K sub(2)HPO sub(4) 0.78g MgSO sub(4)・7H2O 1.5g (MgSO sub(4) 0.73g) DDW up to 1L Stock Solution 3 CaCl sub(2)・2H sub(2)O 1.9g (CaCl sub(2) 1.43g) DDW up to 100mL Stock Solution 6 (カビ易いので注意) Na sub(2)CO sub(3) 2g DDW up to 100mL ) バッファは好熱菌・GT株ではpH8.2 液体培地 Stock Solution 1 2mL Stock Solution 2 50mL Stock Solution 3 2mL Stock Solution 6 1mL Arnon A6 1mL 1M TES-KOH (pH 7.8) 20mL DDW up to 1L オートクレーブ後フタは緩めておき、冷めてから締める。 Stock Solution1は沈殿するので、別にオートクレーブして後から加える。TES - HEPES?(070110) プレート ( Stock Solution 1 2mL Stock Solution 2 50mL Stock Solution 3 2mL Stock Solution 6 1mL Arnon A6 1mL 1M TES-KOH (pH 7.8) 20mL NaSO3g (Na sub(2)SO・5HO 3.7g) BactoAgar 15g 1M TES-KOH (pH 7.8) 5mL DDW up to 1L ) 薬剤を塗るときは滅菌水200uL程度で広げる薬剤を添加するときはオートクレープ後に加えて混ぜる。こちらの方が均一 に広がって良い それぞれを三角フラスコで別にオートクレーブし、後から混ぜてプレートに 注ぐ(1枚20mL) シールせず棚に一晩置いておくと水滴がたまらなくて良い プレートは場所によって水滴の溜まりやすさが変わるので裏表は経験的に調 整する パラフィルムを巻くと生育が悪くなる 培養 薬剤は1/1000量(調整済みあり A冷4下)添加。 綿ろ管は底につけて泡を割らせる。押しつけすぎない。本実験用の培養では薬剤は入れない 時々フォトマルで培養光の強さを調べておくdoubling timeは8〜10h OD=1.0で1×10cells PCC6803の形質転換 OD730=1.0程度の野生株700mLにプラスミドを1uL程度混ぜる プレートにピンセットで形質転換用メンブレンを乗せ、細胞を落としてコー ンラージ棒で塗り広げる メンブレンが浮かないように、端に引っかけてずらすようにして敷くとよい メンブレンの外に細胞を塗らないように、二回りほど小さめに 数分乾燥させて一日培養 薬剤添加培地にメンブレンを載せかえる コントロールを設定する場合細胞を塗り、プラスミドを1uL程スポットする。フタに位置を記録しておく。 またフタの方向も書いておく メンブレンを移し替えるときはフタも移す 植え継ぎは竹串(シアノ用)でコロニーを拾ってプレートに 実験に使用する前に数回経代培養 プライマーの設計 概ね19bp,GC含量50%前後,末端3塩基でプライマーダイマーを作らない,3 末端 はCかG 目的以外のものが増えないかBLASTで簡単にチェック。特にシアノバクテリアには、HIP1 (GCGATCGC) という頻出配列があるので、要注意。 届いたら注文票の濃度を見てTEで0.5mMに調整しストックに ストックから10uM 100uLを調製 TE Tris-HCl(pH8.0)(ストックあり) 10mM EDTA 1mM ゲノムDNA抽出 プレートの1/8程度に細胞を塗り広げる 育った細胞をDW600uLにサスペンドopenでE.coli用竹串で良い 軽くピペッティングして、0.1mmジルコンビーズ0.9gを入れた2mLアシストチュー ブへ移す 15000rpm 30sec 4°C 上清を除いて下記を加える TE 300uL フェノール・クロロホルム(1 1) 300uL A冷2 Trisが重層してあるので下層をとる そろそろon iceで ボルテックス 30sec 3-4回一本ずつ、温度が上がるので氷冷をはさみながら。抹茶色になってきたらOK? 15000rpm 10min 4C 上清に下記を加えて5min以上置いておく( 3M CHCOONa 1/10vol 100% EtOH(A冷1) 2 vol ) 3M CH3COONa 50uL入れたエッペンに上清500uLを入れてEtOHを1mL加えると良 い 中間層のタンパクをとらないように、少なめでも良いのでゴミをとらない 15000rpm 10min 4C 上清を捨てる 70% EtOH 2vol(A冷1)でwash 15000rpm 10min 4C 上清を捨ててdry up 30uL RNase/TE(A冷1 ミニプレップ箱)を加え、37Cで1hインキュベート時々ボルテックスして沈殿が無くなるように(RNAが分解されるように) 保存は-20Cに。PCR用ならTEで500倍希釈するぐらいで良い きちんと取れてるかは1uLを泳動して確認。未分解のRNAがあれば低分子側に 見える segregation check ゲノムをとって挿入部位を挟んだプライマーでPCR PCR 氷上で作業( GenomeDNA(Synechocystisの場合：原種DNA x500)(A冷1段 PCR箱) 1uL 10xPCR buffer @Roche(A冷1段 PCR箱) 4uL dNTPmix(A冷1段 PCR箱) 3.2uL プライマー 1uLx2 HO 26.8uL Taqポリメラーゼ(A冷1段 PCR箱) 1uL (オレンジのシールに無記入) ) まとめて調整し、分注してからプライマーを入れ、最後にTaqポリメラーゼを 入れる Taqポリメラーゼは暖めないように。すぐしまう。ストックはC冷3にあるの で少量分注して使う サーマルサイクラースイッチを入れ F3 AMPLI選択 F2で確認 伸張反応は1分1kが目安 RUN→HOLDで95℃まで上がったらサンプルをセットしてRUN 95℃ 10min → 95℃ 30sec 熱変性 → 72℃ 10min 54℃(Tmによる) 90sec アニーリング 〜4℃ 72℃ 30sec 伸張反応 ×30 cycle アガロースゲル電気泳動 ゲル作製(共用) agar HT 0.8% 1xTBE 160mL エチジウムプロマイド 8.4uL (冷めてから加える) 10xTBE Tris 108g Boric Acid 55g 0.5M EDTA(A冷2) 20mL (EDTA 8.3g) (溶けにくい・結晶化しやすい) ラップで緩くフタをしてレンジで2,3回沸騰させるラップが破裂しないように数カ所穴を開けておくと良い。沸騰したらすぐ 止める 50℃程度(素手で触れるくらい)に冷めたらエチジウムブロマイドを加えて容 器に注ぐ。黒いラインをコーム側にセット 泡が入らないように注意。特に下に入るとゲルが浮いてコームが貫通する。 P1000で空気を押し出すと良い ゲルを泳動漕の溝にセット、穴が電極側。サンプルを下表のように調整しア プライ サンプルはパラフィルム上で調整すると楽 PowerON 100V 30min程度 色素が下から3つめのラインに来る程度で止める ,sample 1uL,1kb ladder 10uL ,6xSTOP 1uL ,HO 4uL 1kb ladder(A冷1段目 ミニプレップ・electrophoresis箱) 6xSTOP(A冷1段目 ミニプレップ・electrophoresis箱) ゲルからの切り出し 切り出し用のゲルはAgarose Lを使用して作るコームの太い側ならウェルに25~30uL程度入る Low meltingゲルは50Vで泳動する。1h程 写真を撮っておくUVを当てるとDNAに変異が入るので手早く 低温室の前のUVランプを使い、スパーテル等で目的のバンドを切ってエッペ ンへ移す 1レーンで数十uL。スパーテル2本使うなどして極力ゲルを除くと良い 切り出したゲルも写真を撮っておく 切り出したゲルを入れたエッペンをflash遠心してvolumeを確認(ここで250uL 程度とする) 1vol(250uL) TEを加える 65C 5min (water bath,ヒートブロック等を使う) 途中数度vortexする 1vol(500uL) 0.1M Tris-phenol(A冷2)を加えてすぐにvortexTrisが重層してあるので下層を取るようにすること ice-boxの中にphenolビンを入れて用意しておく。冷えるとゲルが固まり出 すので手早く この後すべてのエッペンをさらに暫くvortexする 15000rpm 10min 4C 上層をエッペンに取る中間の白いのはゲルの成分とかなので極力避ける (*)1vol(500uL)のBtOHを加えてvortex (*)15000rpm 1~2min 4C (*)上層(BtOH)を捨てる上層は残すぐらいで良い (*)をvolumeが300uL程度になるまで繰り返す(3回程度)BtOHで水を少なくして、エタ沈のロスを減らすためなので省略しても良い 1vol(~300uL)クロロホルム/イソアミルアルコール 24 1(危険物庫) を加えて vortex 15000rpm 5min 4C 上層(~200uL)を新しいエッペンに取る最後の方はチップ内で二層になるので下層を捨ててから移せば良い 1uLグリコーゲン(A冷1ミニプレ箱) を加える共沈させる。低分子のDNAに効果的 1/10 vol(20uL) 3M Na-Acetate (pH4.5) (SDS棚) 2~2.5vol(400~500uL) 100% EtOH(A冷1) vortexしてから-80C冷へ 15min以上 溶かして、15000rpm 10min 4Cここで白い沈殿がそろそろ見えている筈 ppt 70%EtOHを加えて遠心(15000rpm 10min 4C) dry up 6uLのTEを加える 37C 20min 1uL電気泳動して結果を確認 DNA定量(Nanodrop) Nanodrop3.0 - measurement DNA - P2でTEを1uLスポットし Baseline - サンプルを measure で測定260/280が1.8以上だと高信頼性らしい。スペクトルは取っておくこと print screenかsave record LB培地 BactoTripton 1g YeastExtract 0.5g NaCl 1g DDW up to 100mL プレートはagar1.5% 大腸菌凍結保存 60%グリセロール 300uL 培養液 700uL -80℃ グリセロールは20%以下程度にすればよい 使うときは溶かさず竹串でつついて少量取ってすぐに冷凍庫へ戻すこと 大腸菌形質転換 BL21(DE3) [-80℃ 上3-左2-2] on ice 10min SOC培地・Km準備等 add plasmid DNA (1uL) on ice 30min 42℃ 45sec heat shock on ice 2min add 37℃ SOC培地 (450uL) 37℃ 1h 振とう培養 選択培地にplating 37℃ overnight (307B 共通インキュベーター) コロニーが育ちすぎないように冷蔵庫に プレ培養 プレートを室温に凍結保存のストックがある場合はここから LB培地(共用) 大量培養の1/100量を滅菌済み三角フラスコに(+薬剤) プレートから竹串(E.coli用)でコロニーを拾う(5個ぐらい拾って混ぜちゃう) 37℃ overnight 振とう培養 大量培養用LB培地を作っておく。薬剤は粉末で加える 大量培養はLB培地に 25℃ 10h 振とう培養(130rpm) 大腸菌用遠心管(500ml)に分けて遠心。5000rpm,4℃,10min 上清を捨てて沈殿を掻き取って-80℃で保存 水浴の空焚き注意 SOC培地はA冷4下 使ったらすぐ冷凍 大腸菌用KmはA冷4下 大腸菌用遠心管 HITACHI シアノバクテリア用 Nargen 器具は熱湯消毒。使用済み培地はオートクレープ後トイレの用具入れの流し にとか。 プラスミドの用意、形質転換(+amp) 発現check、6コロニーで15000rpm,5min、上清と沈殿をSDS-PAGE。場合によっ ては抗His-tagでウェスタン Niカラムで精製。5gぐらいとれる 大腸菌について BL21(DE3) タンパク発現用大腸菌。F-, ompT, hsdSB(rB- mB-), gal(λcI 857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm(DE3) (B株由来) BL21(DE3)pLysS (-80℃1-2-3)リゾチームを少量発現して基底タンパク質発 現量を抑制、毒性タンパク質の発現に。 JM109 recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17(rK- mK+), e14- (mcrA-), supE44, relA1, Δ (lac-proAB)/F [traD36, proAB+, lac Iq, lacZΔM15] JM109(DE3) タンパク発現 XL10-Gold (-80℃右奥)Tetr Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Tn5 (Kanr) Amy] プラスミドについて pET pBR322由来low copyプラスミド。IPTGは入れなくても十分発現するので 入れたり入れなかったりらしい。 タンパク質の精製 超遠心機・ローターの予約 超音波破砕機の冷却(5℃) 細胞破砕後、タンパク質は常に氷上で冷やす カラムの洗浄Niカラム(C冷蔵庫2段目) 下記の順番でカラムを洗浄する 使用後は空運転させて水を抜くPeristaの左側にアダプタがついているのでスイッチはLで カラムに空気が入らないようにミリQを流しながら取り付ける 洗浄液に応じて吸引側のチューブはDWで洗浄する Niカラムは容量5mL ,洗浄液,流量(カラム容量に対して) ,MiliQ,2 ,2%SDS,3 ,25%EtOH,1 ,50%EtOH,1 ,75%EtOH,1 ,100%EtOH,3 ,75%EtOH,1 ,50%EtOH,1 ,25%EtOH,1 ,MiliQ,1 ,EDTA,3 ,MiliQ,2 ,100mM NiSO・6HO,2 ,MiliQ,2 BufferA・B,MilliQの脱気上記の順に脱気すると洗浄の手間が省ける ホースを抜いてからインキュベーターのスイッチを切る なるべく泡を立てないように横の穴から容器に移す 大腸菌の超音波破砕シアノバクテリオクロム単離には超音波破砕は不適。フレンチプレスを使用する。 超音波破砕機をセットしてから循環水のスイッチを入れる。冷えるまで20分程度超音波破砕機は100ml程度まで入れられる。留め金のゴムがきちんとセットされているか確認 BufferA 50mlを入れて(ファルコンチューブで目分量)、そこに大腸菌を入れる。5分溶かしてから懸濁。泡立てない大腸菌1gにBufferA 10mlが一応の目安 遠心管を冷やしておく 超音波破砕(3min破砕→3min休み 5セット)tuningで高音がもっとも出る所に合わせ、levelで180Wに 破砕液を25mlの遠心管に移す 破砕液の超遠心 P1000・チップ・BufferA・BufferB・MiliQ・シリンジを低温室に低温室でBufferAを入れてバランスを合わせる ローターはRP50T-2-161使用 超遠心機にセットしてVacuumを押して真空にするHITACHI 55P-72 Vacuumは二段階目(5min程度・表示あり)から回し始めてよい CP70MX Clearでアラームを消しておく。OILはVacuumになると自然に消える。Vacuumはメータの右下のボタンで確認(確認したらすぐ戻すこと)、目印まではいかないので40kなら15-20分程度でよい。立ち上がりが遅いので10分程長めに 40,000rpm 30min 4℃ Accel・Decel 9ローター・遠心機の使用記録をつけ、使用後はDEFボタン(CP70MXはBACK)で乾燥させてから電源を切る この間にAKTAPrimeのUVランプを点けておく 上清を50mLチューブに回収、B bufferを1.5mL(イミダゾール3%になるように)加える ペレットにMiliQを8割程度入れて超音波破砕、エッペンにとる サンプルループの準備黒いゴムが下になるように中の仕切を入れ、下側に水を満たして栓をする。上も同様。泡をなるべく入れない AKTAPrimeでタンパク質の分画を行うSet parameter→Lamp ON 30分待つ Manual run 吸入口(A・B)をMiliQにセットし、システムの洗浄を行うflow rate 2mL/min,B 50%で6mlずつ程度、load,inject,westを洗浄 injectでflow rate 1mL/minにし、MiliQを流しながらサンプルループをセットする水が流れてくる方がサンプルループの上 アダプタ部分は二段になっているのでケーブルを捻らないように取り付けられる 吸入口を動かす際は必ずPauseで一時停止すること flow rate 2mL/minにし、サンプルループの区切りが下がりきったらLoadに切り替える Pauseして吸入口AをA Buffer 吸入口BをB Bufferに。B 3%にするキムワイプなどで管が外れないようにおさえる flow rate 1mL/minにしてカラムをセット 水漏れがどこにもないことを確認 flow rate 2mL/minで平衡化するまで流し、AUをajust zeroでゼロあわせするコンドミニマム(塩濃度)が上がらなくなるまで Pauseして10mLシリンジを用いてサンプルを注入、サンプルループ内に入っていくことを確認残りをcrudeとしてエッペンに少量取っておく レコーダーの設定、zeroで零点の設定,Pen Down,10mm/minAjustダイヤルでイミダゾール濃度は1メモリ1%とかにするとよい。 BufferB 3%,inject,flow rate 1.5mL/minであることを確認してサンプルを流す(start run) AUが上がり始めたらflow throughとして50mL程度回収。一部エッペンに。残りは捨ててよい サンプルが流れきったらLoadに切り替える多少サンプルが残っても良いので、サンプルループ内の泡まで流れないようにする 装置によってはサンプルが流れきってまだ流し続けると圧力が上がるので注意 AUが下がりきるまで待つ(5分程度)。 B 5%に切り替える。5分程度待ち、AUが上がったら回収 B 10%に切り替える。10分程度待ち、AUが上がったら回収ここまでは大体ゴミが出てくる。5%を短め、10%を長めでもよい この間にフラクションコレクターにエッペンを並べる。内側から、フタが内側のエッペンの上に重なるようにし、マーカー位置を合わせる Set Gradient ON,Set length 90mL,Fraction size 1.5mL,Gradient 10-40%にセット ときどき様子を見てエッペンのフタを閉める Gradientが40%になったら100%まで上げるこの間にAUが上がり始めたらまた回収する 暫く100%で流し、最後に0%に戻す Printerでデータを印刷 MiliQでinject,loadを洗浄。フラクションコレクターは排出口を中央に合わせると捨てられるflow rate 2mL/min,B 50%で6mlずつ程度 Lamp OFF、本体の電源は点けておいてよい A buffer (C冷蔵庫一段目) HEPES(pH 7.5) (1M HEPES C冷2) 20mM NaCl 100mM Grycerol 10%(w/v) MiliQを使う。広口ビンで用意 B buffer (C冷蔵庫一段目) A buffer イミダゾール (1Mにする) HCl pH 7.5 MiliQを使う。広口ビンで用意 SDS-PAGE ゲルの作製エタノールでゲル板とコームを拭いて乾かす ゴムを食い込ませず、引っ張りすぎないようにして巻く 100%EtOHやDWで漏れないか確認しても良い。余り濾紙で拭いておくことゲル板の傾斜が内側に来るように Separate gel,Stacking gelを調整,TEMEDのみ注ぐ直前まで入れないAPSだけなら入れても当分固まらない Separate gelをP1000で注ぎ、ブタノールを薄く重層するコームの歯より1cm程の高さまで 15分程度で固まるので(三層に見える)、ブタノールを捨ててDDWで軽く洗い、余り濾紙で拭く Stacking gelにTEMEDを入れコームを刺して15分ほど固めるstacking gelは数mmあれば十分なのでコームは奥まで入れる コーム、ゴム、クリップの順で外し、DDWで洗う 泳動漕を組み立てて1×レムリを注ぐ ,,stacking gel(5%),(3%),Separate gel(5%),(7%),(8%),(10%),(12%),(15%),(17%) ,60%AA,0.17mL,0.1mL,0.66mL,0.93mL,1.07mL,1.3mL,1.6mL,2.0mL,2.26mL ,x8 buffer,,,1.0mL,1.0mL,1.0mL,1.0mL,1.0mL,1.0mL,1.0mL ,x10 buffer,0.2mL,0.2mL,,,,,,, ,dHO,1.63mL,1.70mL,6.34mL,6.7mL,5.93mL,5.7mL,5.4mL,5.0mL,4.7mL ,10% SDS,20uL,20uL,,,,,,, ,10% APS,16uL,16uL,16uL,16uL,16uL,24uL,24uL,24uL,24uL ,TEMED,3uL,3uL,3uL,3uL,3uL,4.7uL,4.7uL,4.7uL,4.7uL TEMED A冷2 APS A冷1タンパク箱 ラージゲルは2.5倍量 固まるのに倍時間程度 染色液3倍量 サンプルの調整下表の用に調整 サンプルをヒートブロックで熱変性、95℃ 3min膜貫通タンパクなどは45-55℃ 1hで変性させられる 遠心機のFlashingでサンプルを落とす ,Sample 10uL,LMW 5uL ,2% DLT 3uL,2% DLT 3uL ,0.25% BPB 2uL,0.25% BPB 2uL LMW,DLT,BPBはA冷1タンパク箱 泳動電極を刺してサンプルをアプライ POWER ON(MODE C・C(定電流),25mAで80min 10mAで2hが目安) 染色DWで洗ってゲル板を外し、タッパーに入れて固定染色液に漬けるゲル板はスパーテル等で外すが、横側は割れやすいので下から差し込むこと 浸透機に置き30min 染色液をCBB用廃液に捨てて、脱色1液・畳んだキムワイプを入れる 浸透機に置き30min 脱色1液を捨てて脱色2液を入れる 浸透機に置きovernight ミニゲル乾燥乾燥台にろ紙を乗せてDWで湿らせ、その上にゲルを置く 泡が入らないようにセロファンを乗せ、DWで湿らせながら皺をとる ゴム板をかぶせて吸引しながら80℃で二時間程度 ゴム板をめくってゲルを取り出す先に吸引機を止めると逆流することがある。また、なるべくチューブは抜き差ししたくないので ,,固定染色,脱色1,脱色2 ,dHO,20mL,30mL,45mL ,酢酸,5mL,5mL,5mL ,,CBB 25mL,MeOH 15mL, ,時間,30min,30min,over night LMW調製 LMW(C冷2段目) スクロース(A冷1段目タンパク箱) 説明書の通りに調製、泡立てない 60%AA ビス(C冷2段目) アクリルアミド(低温室) 湯煎しながらミリQで250mLまでに調整 ブロッティング 手袋をすること blotting buf 300mL(ミニゲル。ラージゲルは2倍量) 0.531 Borric acid 240mL DW 60mL MeOH (特級) 1.65mL 10%SDS (MeOHの溶解による泡が消えてから、泡立てないように) メンブレン ゲル程度のサイズに切るアミノ酸シークエンス用メンブレンあり。(PSQ用) ろ紙 メンブレンより一回り大きく、メタノールで拭いた裁断機で切るミニゲルなら10cm×6cm 8枚 ラージゲルなら15cm×16cm 12枚 ミニゲルの時は12cm×10cmと切って必要な分だけ10cm×6cmに タッパーはなるべくCBBで染まってないものを。染まってたらメタノールでよく洗っておく ろ紙は3,1,4とずらして置いてblotting bufに浸す メンブレンをMeOHに5分間浸す blotting bufを入れたタッパーに、ろ紙1枚・ゲル・メンブレンの順に重ねる ATTAにろ紙4枚を乗せ、MeOHで拭いた試験管などを転がして空気を抜く ろ紙1枚・ゲル・メンブレンをメンブレンが下になるように、ひっくり返して乗せる。空気を抜く ろ紙3枚を乗せる。空気を抜く。blotting bufを上から少しかけておく 電極をセット。定電圧(C・V)で10V 90min通電していないと電流量が凄いことになるので見ておくとよい。だんだん下がってくる。 ゲルの方向と位置・メンブレンの裏表などを、切ったり穴を開けたりしてメンブレンに記すゲルはCBB染色して、きちんとメンブレンに写ってるか確認 アミノ酸シークエンス アミドブラック処理乾燥したメンブレンをメタノール処理(5分浸す) アミドブラックに浸してすぐにDWで洗う スキャナをエタノールで拭いて読み取っておく アミドブラック染色液 ( CHCOOH 10% MeOH 50% DW 40% アミドブラック 0.1%(w/v) ) アミノ酸シークエンサーエタノールで拭いたカッターと定規でメンブレンのバンドを5mm×2 6-7mm×1 程度に切って試料とする スキャンしたメンブレンのコピーに切った部分を記す 以下PPSQ-21用簡易マニュアル参照 読むのは10残基程度 BN-PAGE Blue-Native PAGE Methods (Schägger et al. 1991 vol. 199 page 223-231. Anal. Biochem.) Stock solution Solution Composition Deep blue cathode buffer 50 mM Tricine, 7.5 mM imidazole, 0.02% Comassie blue G250 Slightly blue cathode buffer 50 mM Tricine, 7.5 mM imidazole, 0.002% Comassie blue G250 Anode buffer 25 mM imidazole/HCl (pH 7.0) Gel buffer 75 mM imidazole/HCl (pH 7.0), 1.5 M 6-aminocaproic acid AB-mix (49.5% T, 3% C) 48 g acrylamide, 1.5 g bisacrylamide per 100 mL 5% Comassie blue G250 Suspended in 500 mM 6-aminocaproic acid Gradient gel preparation stacking stacking separate separate separate 3% T 4% T 3% T 5% T 13% T AB-mix 0.18 mL 0.25 mL 0.55 mL 0.94 mL 1.95 mL Gel buffer 1 mL 1 mL 3 mL 3 mL 2.5 mL Glycerol 1.5 g Water 1.82 mL 1.75 mL 5.4 mL 5 mL 1.5 mL Total 3 mL 3 mL 9 mL 9 mL 7.5 mL 分離ゲルは、3% T or 5% Tを3.99 mL、13% Tを3.33 mL分取し、3% or 5% T-13% Tの直線的濃度勾配のミニゲルを作る。分離ゲルの濃度は、分子量のレンジが50-10,000 kDaの時は3% Tを使い、この時のstacking濃度は3% T。50-1,000 kDaの時は5% Tを使い、stackingは4% Tを使う。 Mini gel preparation stacking stacking separate separate separate 3% T 4% T 3% T 5% T 13% T Total 3 mL 3 mL 3.99 mL 3.99 mL 3.33 mL 10% APS 25 µL 22 µL 22.1 µL 20 µL 16.6 µL TEMED 2.5 µL 2.2 µL 2.2 µL 2 µL 1.6 µL ゲル作製時はペリスタポンプの速度を目盛り4に設定し、スターラーの速度は目盛りの8から5まで順次下げながら撹拌速度が一定になるようにする。分離ゲルが全部流れたら、水飽和ブタノール（上層）をそっと重層する。ゲルは1~2時間で固まるはず。分離ゲルが固まったら、ブタノールを捨て、stackingの液（APS, TEMEDを加えたもの）で素早くゲルをすすいでからstackingを流す。コームをさして静置。ゲルが完成したら4°Cに冷やしておく（前日に作製することをおすすめします）。 泳動泳動は全て4°Cで行う。 準備大きめのビーカー（プラスチック）、10 mL 駒込ピペットまたは代わりになるもの、泳動層、電極（30 min前までに低温室に持って行き、電源をつけておく。）、プラグ、ピペットマン、チップ。Bufferはあらかじめ4°Cにしておく（4°Cで保存しておいても良い。CBBが溶出することもあるかも。）。 サンプルロードサンプルは6 µg Chl a/レーンくらいがよい。(光化学系複合体の場合) ゲルからコームを外し、Deep blue cathode bufferで一度洗い、もう一度ウェルにDeep blue cathode bufferを入れておく。 ゲルを泳動層にセットし、サンプルをロードする。（この時cathode bufferは入れない。） サンプルをロードしたら、cathode bufferをそっと入れる（サンプルが乱れないようにする）。 電流、電圧は、サンプルがstackingを泳動している間は50 Vで行い、分離ゲルに入ったら250 Vまたは7.5 mAに調製する（どちらか小さい方に調製）。 サンプルの先端が分離ゲルの上から３分の１に到達したら、陰極側のbufferをDeep blue cathode bufferからSlightly blue cathode bufferに交換する。 泳動時間は約4時間ほどで終わると思う。 分子量マーカーはHMWのゲルろ過用を用いた。 Bradford法によるタンパク質の定量 BSA標準溶液(2mg/mL)(C冷2)を希釈 検量線用の希釈系列を作る (0.75-0.125mg/mL程度)検量線用BSAは調製後、個人で-20℃冷蔵庫に入れておく 測定試薬 Bio-Rad ProteinAssay(C冷2) を5倍希釈して使用チューブが染まるので、CBB希釈用として個人で持っておく 20uLタンパク質に測定試薬を1mL加える0mLサンプルはMiliQ20uL。標準・試料同時に行う 3分間ボルテックスにかける3-5分で任意。ただし長いと吸光度が1を超えやすくなるので短めがよい 595nmの吸光度を薄いものから測るMiliQで零点。経時的に吸光度が上がっていくのでなるべく手早く。測定はパスツールピペットを使うと良い 近似曲線のR^2の値が1に近い程良いが、吸光度0.8あたりから線は寝てくる 透析 手袋をすること 透析チューブを適当な長さに切り、DWに付けてレンジで温める。5min程度 チューブの中までDWで洗う。これを三回繰り返す 低温室へ。ビーカー、スターラーバー、透析クリップ、はさみ、P1000、チップ チューブの片側を二回ほど結んで余りを切る EDTA処理1mM EDTAを加えて一時間整地 0.5M EDTA A冷2段目扉裏 プルダウンアッセイ シアノFTはアルミで遮光して保存しておいた方がよいかも 準備電気泳動用試料として、精製His-tag付きタンパク質・シアノバクテリアのflowthroughをエッペンにとっておく 精製His-tag付きタンパク質、オープンカラム1mL MiliQ 10mL→イミダゾール濃度30mM buffer10mLで平衡化 シアノバクテリアのflowthrough 25mLを超遠心 40k,4℃,30min Peristaはカラムの下部に取り付けて吸引 もう一本のチューブでカラムへアプライ protein bindingタンパク質をイミダゾール濃度が30mMになるよう希釈 Peristaでタンパク質を流し、カラムに結合させる→電気泳動用に回収 イミダゾール濃度30mM buffer10mL程度でwash→電気泳動用に回収 PeristaでシアノFTを循環させる。overnight→循環終了後、電気泳動用に回収後ろの締め付けネジを微調整して流量をあわせ、カラム内は常に一定の液量が保たれているようにすること カラム直下にチューブを置いておく等、チューブの脱離・カラムの液溢れ対策はしておいた方が良いかも イミダゾール濃度30mM buffer10mL程度でwash→電気泳動用に回収 イミダゾール濃度を1Mにして回収 水に浮きやすいタンパク質があるので、washはカラムぎりぎりまで通してから 分析電気泳動後、FMBIOでフィコシアニンのバンドを同定しておく ゲルシフトアッセイ Electrophoretic mobility shift assay(EMSA) 泳動ゲルの作製以下の溶液でラージゲルを作る 60%アクリルアミド/1.6%ビスアクリルアミド 2.3mL 1xTBE 20.6mL 10% APS 76.6uL TEMED 23uL TEMEDはゲル板に流し込む直前に加える いっぱいまで流し込んでコームを刺す 固まりにくいので前日に作っておく。37C 1hに置いたり、アクリルアミドを脱気したりしても良いらしいがやったことはない。固まる前に低温室に置かない。 ラージゲル乾燥用濾紙・セロハンを切っておく TBE・ろ紙・セロハン・サンプル(DNA,タンパク質)・泳動ゲル・RIカード・ USBメモリー プローブの標識water bathの用意 以下の溶液をエッペンに入れる。[γ]-ATPは最後に加えるピペッティング・ボルテックスはせずに指で弾く程度が良い DNA (例えば250bp,65ng/uLなら1~3uL) 10x kinase buffer(RI冷1右扉裏) 5uL [γ sup(32P)]-ATP 5uL T4 polynucleotide kinase(RI冷1右扉裏)(最後に入れる) 2uL(20U) H sub(2)O up to 50uL DNAは全量100uL(プロトコルの3倍量)でPCR - 20uLずつ5レーンに流して切り出しで十分取れる [γ]-ATPはアマシャムのredivue品 9.25MBq(AA0068)を使用 37C 30min 酵素反応この間にヒートブロックを75Cにし、カラムの準備、電気泳動のプレランもしておいて良いかも 75C 5min 酵素を失活させる カラムの準備nap5 脱塩カラムをスタンドにセットしバイアル瓶を廃液受けにする。上下のふたを取って中の液体をすべて流し出すカラムの高さは適当に調節、高すぎると出てきた液体が跳ねるので注意 緩衝液10mLをカラムに流す 緩衝液 NaCl 80mM Tris-HCl 50mM 完全に液体が流れ落ちる前に下のフタをして、プローブの標識が終わるまで置いておく プローブの精製エッペンを10本フタを開けて並べておく カラムから緩衝液をすべて流し出し、標識したプローブをカラム内のゲルの上に入れる色が付いているので見てわかる。完全にゲル内に入るまで待つ 450uLの緩衝液をカラムに入れて液体が完全に落ちきるまで待つ カラム直下に用意しておいたエッペンを置く 各100uLの緩衝液をカラムに入れる→2-3滴の液体をエッペンに取る。この操作を10本分行うカラムが高すぎると液が跳ねるので注意 概ね3-5番にピークが来る。サーベイメータに近づける事である程度のあたりはつけられる エッペンを軽く弾いてからflash遠心で液を落とす シンチレーションカウンター用のバイアル瓶にエッペンを入れ、そこに1uLずつ取ってシンチレーションカウンターでβ線を測定する 手前側のピークのエッペンを実験に用いる。前後のエッペンも取って置く。スポット用に前後の弱めのを持っておいても良い貯蔵庫の-20Cで保管 プローブとタンパク質の結合例えば以下のような組成で液を混ぜ、15~30min 室温でおいておく。標識プローブを入れてからタンパク質を入れる 軽く遠心して室温で15~30min静置 ,タンパク質(ug),4xバッファー(uL),HO,標識プローブ,coldプローブ ,0,4,up to 16uL,1uL,0 ,0.25,4,up to 16uL,1uL,0 ,0.5,4,up to 16uL,1uL,0 ,1,4,up to 16uL,1uL,0 ,0.25,4,up to 16uL,1uL,適量(Hotの100~400倍) ,0.5,4,up to 16uL,1uL,適量(Hotの100~400倍) ,1,4,up to 16uL,1uL,適量(Hotの100~400倍) coldプローブはHotの標識に使った量をそのまま入れても良い(精製時で100倍以上に希釈されているため) バッファーの組成はタンパク質による、以下に例示 HEPES-NaOH 10mM NaCl 50mM EDTA 1mM DTT 1mM glycerol 10%(v/v) poly dI-dC 10ug/mL BSA 1ug/mL 4x バッファー調整例 1M HEPES-NaOH(C冷2) 10uL 1M NaCl 10uL 0.1M EDTA(0.5M A冷2) 2uL 0.1M DTT(1M A冷1 ミニプレ箱) 2uL glycerol 20uL poly dI-dC(A冷1右扉裏) 10uL 0.1mg/mL BSA(10mg/mL A冷1タンパク箱) 2uL DW up to 50uL 6xSTOP(RI冷2)を泳動度の目安として用意 電気泳動1xTBE緩衝液とゲル板を泳動漕にセット ウェルをピペットですすぐ CV 20mAで1h prerun サンプルをアプライしてCV 20mAで1h泳動するサンプルは無色なのでマジックでレーンに番号を振るなどしておくとどこまでアプライしたかを見失いにくい 最近接触が悪いのか、きちんと流れていない事があるので注意 6xSTOPの青い色素が半分程度まで流れるぐらい ゲル板で遮蔽されるのでこの時は遮蔽板は不要 流しでゲル板を外す泳動バッファーにはほとんど放射能は残らないはず。流す前にサーベイしておく スパーテル等でゲル板を開けて裏側に濾紙を乗せる ゲル乾燥機に2枚ほど濾紙を乗せて、その上にゲルが上になるようにゲルと濾紙を乗せて、セロハンをかぶせて乾燥 2h濾紙の上に弱いRIをスポットしておくと目印になる きちんと吸引されているか確認 この間にIPを消去しておく 終わったらゲル乾燥機を汚染していないかチェックしておく 使用記録を書く 放射線検出IPを消去。消去器に白い面が露光されるようにセットして20~30min 乾燥したゲルをIPと一緒にカセットにセットする。IPの白い面がゲル側に来るように重しを乗せるなどして密着するように要工夫 IPは濡らすと使えなくなるので注意 露光 RIの強さにより10min~over night BAS-2500の起動。初期化に10min程かかるフタを閉めるときに"プシュッ"となればきちんと閉まっている。きちんと閉まっていないと初期化が終わらないので注意 多めに当てておくとバックグラウンドが減るが、当てすぎると定量性が失われるので注意 RI到着直後なら10minでおおざっぱに見える。30~240min程度 DarkでIPを白い面を上にしてBAS-2500にセット Image Reader - Gradation 16bit,resolution 50,sampling area 設定 - Read 画像が出たらOK - Export File - TIFF MOかUSBメモリーで持ち出し未使用時はカセットを開けておく 使用後のゲルは保管廃棄室の棚へ 濁度(OD730) OD730=1で1×10^8Cellsになるように補正式あり [OD730修正用.xls] クロロフィル量の測定 遠心(15000rpm,3min) 上清を捨ててメタノールを加える ソニケーション。沈殿が見られなくなるまで 遠心(15000rpm,3min) OD665×13.4がクロロフィル量(ug/mL) 吸収スペクトル 鍵(15-B07)・P1000・DW・ブラックセル・FD・試料(OD730=2.0に調製 1mL程度) 分光光度計(U-3500)で測定。350〜800nmの範囲、エンドオン型フォトマル装着、細胞の吸収スペクトル測定に適している 分光光度計(U-3500) 電源ON スペクトル測定を選択 安定化(10min) 黒いカバーを外す 測定条件設定→測定→ユーザー1設定 ブランクを入れてユーザー1ベースライン測定 試料測定 (a \uv40\spectrum\)保存・変換→FD保存せず、変換で保存先に直接FDを選択してもOK 電源OFF PC,Chl量計算のため試料のOD730をUV-2400PCで測る。 2ビーム透過型分光光度計。溶液や薄膜試料に最適。散乱の大きい試料の測定に良いらしい。 低温吸収/蛍光スペクトル 液体窒素・鍵・P200・DW・試料(chl 5ug/mlに調製 200uL)・タイマー・アルミホイル・FD試料を調整するときは遠心時に冷やさないように注意 RF-5300PCで測定する。フォルダを入れ替えてフタをはめてLN2を入れる。キュ ベットも冷やしておく 2時間冷却待ち 測定器とPCの電源ON,PCでRF-5300PC起動 設定→PC設定→COMポート(1)選択。保存先・変換保存先も入力しておくと楽 設定→装置設定→照明ON 試料を入れるトコだけトイレの水道で溶かす 試料を入れてアルミを巻いて暗幕かけて10分待つ アルミ巻いたままLN2で冷却 アルミ剥がしてセット、620〜800nmで測定。範囲は150程度。励起バンド幅10nm蛍光バンド幅5nm、クロロフィルは435nm、フィコシアニンは600nmの吸収を見る。リピートスキャン10回。シャッターは検出器を保護するために測定時以外はOFFに ファイルをチャンネルに開いて変換→FD 電源OFF、フォルダを戻しておく。 何も出ない時はバンド幅を変えて一回測定してみると良い バンド幅は回折格子からのスリットの幅、上げると見辛かったピークが出る事も キュベットは常に同じ物を使う(落書きあり使用) 90°では散乱が大きすぎるので少しずらした所にセット(印あり)。 成川 励起スペクトル励起光の波長を変えてのスキャン。検出範囲は測定光より長波長より設定すること 連続測定キャンセルで測定後に名前を聞かれる BLAST検索 NCBI→BLAST→Genomes→(Microbes)→配列をペースト、サーチする生物種を選んでBLAST 配列のアライメント。clustalxを用いる。 結果をBioEditなどで整える。NJTreeなんかで系統樹も描ける。 Sequence Retrievalをチェックしておくと、結果で出てきた配列を再検索してFESTA形式に出来る。 ゲノムサイズが違いすぎて、pBLASTのスコアの低い蛋白質も、SMARTなんかでドメインで比較なんてすると関係あったりするかも。 annotationは元の論文を見てみないとどこまで信用出来るかは不明。
https://w.atwiki.jp/petfood/pages/32.html
このページはモバイルユーザビリティを考慮し分割されました 2chログより入りなおしてください
https://w.atwiki.jp/deadbydaylight/pages/619.html
概要 背景 マップの構造 固有建築 解説生存者から見て 殺人鬼から見て 変更履歴 コメント 概要 コール・タワーCoal Tower 固有建築 2階建ての倉庫 屋内外 屋外 親マップ マクミラン・エステート 面積(平方メートル) 8448（132タイル） ※タイル数は、8x8平方メートルの領域が何個入るかの指標。 マクミラン・エステートのマップの1つ。 背景 かつて製鋼所の動力となる石炭を保管していた場所であったが、放棄されている。天井は巨大な爆発があったかのように裂けているが、角度からして辻褄が合わない。ここで何があったかを推測するのは容易ではない――誰が真相を望もうとも。 マップの構造 中央に横に積まれた木、あるいは鉄塔（コール・タワー）が生成され、その北に固有建築、南に殺人鬼の小屋を有する。 脇にはジャングルジムや板のある地形、丘が生成される。 固有建築 向きは固定で生成される。 1階固定でロッカー2個が生成される。 1階中央の障害物にはトーテムが生成される可能性がある。 1階の2階へ続く階段の裏には地下室が生成される可能性がある。（小屋に生成されるかのどちらか） 窓枠の生成パターンは2パターンある。必ずその脇の出入口は破壊可能壁が生成される。 固有建築の外周には必ず板が2枚生成され、固定でフックが1本生成される。 2階固定でチェストと発電機が生成される。 3方向に出れるうちの1方向は破壊可能壁によって塞がれている（塞がれている方向は固定）。 解説 生存者から見て 固有建築でのチェイスは窓と板を組み合わせる必要がある。 固有建築周りの板は生成によってほぼ追いつかれない板になる場合もあるが、基本的には弱い板。 ステージ中央に丸太あるいは鉄塔が確定で生成されるため、そこを境に発電機が偏らないように注意。 他ステージと比べてジャングルジムが生成されやすいため、チェイスはしやすい。 殺人鬼から見て 縦に長いステージのため機動力のある殺人鬼は巡回がしやすい。 また、中央を境に発電機も比較的偏らせやすい。 固有建築は破壊可能壁がある状態ではチェイスがしづらいため、できれば序盤のうちに破壊しておけると後々のチェイスが楽になる。 破壊すれば回り込みやすいので、むやみに乗り越えず先読みや渇望で追いつこう。 変更履歴 Patch 4.3.0グラフィックアップデート実施 コメント 名前 最新20件を表示しています。ログ全文? コメント左側の◯をクリックしてから書き込むと、レス形式でコメントできます。
https://w.atwiki.jp/aimi-mcc/pages/846.html
やんちゃタイプのごはん会話内容です。 (表情サンプル モエン目型 ／ 課金目型) 食べる もう少しでお腹と背中がくっつくとこやったわ～。 (ｳｲ) あ～もうお腹ﾍﾟｺﾍﾟｺや！我慢できひん!! (哀) いただきますを忘れたらあかんで～!! (笑) メニュー リアクション 梅茶漬け ん～!!このすっぱさがたまらへんっ!! (笑) ｵﾑﾚﾂ ｵﾑﾚﾂとｵﾑﾗｲｽの違いて知っとる～？ (笑) ｶﾚｰ ん？今誰かおつｶﾚｰとか言わんかった？ (呆) 牛丼 紅ｼｮｳｶﾞを乗せたら、いっちょあがりや～!! (笑) 生姜焼き お～お～!!あっちゅーまに体力が回復してもーたわ!! (笑) ｽｺｰﾝと紅茶 あ～落ち着くわ～。たまにはこーいうのもええな!! (閉) ｾﾞﾘｰ 口の中めっちゃﾌﾟﾙﾌﾟﾙしてるで～！ (笑) たこ焼き たこ焼きさえあればご飯何杯でもいけるわ～!! (閉) ﾊﾝﾊﾞｰｸﾞ なぁなぁ、ﾊﾝﾊﾞｰｸﾞやったらｿｰｽは和風派？それともﾃﾞﾐｸﾞﾗｽ派？ (微) ﾓｴﾓｴﾒｲﾄ なぁ、まさか……これでご飯済ませる気ちゃうよな!? (驚) ﾓｴﾁｯﾌﾟｽ やめられへんとめられへん♪ (笑) 焼き魚 魚食べたら、頭よくなるってﾎﾝﾏなん!? (驚) ﾗｰﾒﾝ はよ食べな麺が伸びてまうで～？ (微) メニュー リアクション 甘口ｶﾚｰ 甘口やったら、たこ焼きにかけても合うかもな？ (微) お好み焼き よっしゃ!!ﾅﾆﾜの腕を見せたるわー!! (怒) ｵﾑﾗｲｽ () ｻﾌﾟﾘﾒﾝﾄ ｺﾚだけで栄養摂ったつもりになったらｱｶﾝで!! (怒) ｽﾃｰｷ 何ｸﾞﾗﾑ食べきれるか勝負せえへん？ (微) つゆだく牛丼 つゆのかかったご飯ってなんでこんな美味いんやろ？ (微) とろ～りﾋﾟｻﾞ （《ｱﾝﾀ》のあの目……ﾋﾟｻﾞを使った一発芸を期待する目やな……どないしよ） (閉) にくじゃが じゃがいもがめっちゃﾎｸﾎｸしてるやん～味付けもちょうどええな!! (驚) 煮魚 しっかり味がしみてるわ～！時間かけた甲斐があったな～♪ (笑) ﾊﾊﾞﾈﾛｶﾚｰ () ﾊﾟﾝｹｰｷとﾛｲﾔﾙﾐﾙｸﾃｨｰ () ﾌﾙｰﾂﾊﾟﾌｪ 甘い物とたこ焼きは別腹やで～～～♪ (ｳｲ) 明太茶漬け へぇ～お茶と明太子って意外と合うんやな～。 (微) ﾓｴ系ﾗｰﾒﾝ なぁ、見てみ？ﾅﾙﾄが可愛いｷｬﾗになってんねん!! (笑) ◆好きなメニュー 食べる ごはんは闘いやで？ぼーっとしてたらあっちゅーまになくなってるもんや！ (閉) リアクション はっ!!……ほっぺた落ちてへん!? (驚) ◆23時以降 食べる ちょっとだけなら……別にかまへんよね？ (困) リアクション あかん!!全部食べてもーた!! (驚) コメント一覧 名前 コメント すべてのコメントを見る
https://w.atwiki.jp/silverphilosopher/pages/250.html
ヴァール・ルビコール 登録日：2010/05/01 Sat 13 40 投稿先：海の王国惑星！No. 2 更新日：2014/08/08 Fri 02 10 43 ▽タグ一覧 Gex10超 ローグリエル大帥軍 人物 戦士 王 男性 名前 ヴァール・ルビコールヴァール・ラクシモン・シーア・アフロトゥス・ルビコール 種族 クラクメアー 体格 身長3.4ｍ 主な能力・地位 惑星クラゴメーア国王、クラゴメーア水神党総統、ローグリエル大帥軍大帥 親族関係 主要活躍宙域 リーヴァス・アヴィエラ銀河団 スペック Gex11.0 活躍年代 基準時～ メインページリンク プロフィール 3.4ｍの巨躯と筋肉質な体躯を誇るクラクメアー(クラクメアーは大柄だが、その中でも巨躯と言える)で、惑星クラゴメーアの国王。 クラゴメーア水神党を率いる軍人としての一面もあり、ローグリエル大帥軍をはじめとするセイヴァネスロードにも支援勢力として参加。 自身もローグリエル大帥軍大帥の地位を持っている。 本名ヴァール・ラクシモン・シーア・アフロトゥス・ルビコールだが、通常ヴァール・ルビコールで通っている。 伸縮自在の三又の槍を持ち、王族用に特別調教された長大なヘビ型竜、パルシェザウスにまたがる。 海戦や高分子内戦に極めて優れているほか、海を大規模に凍らせるなど、氷冷系の技に大変優れている。 国王と言っても政治は部下の官僚がほとんどしきっており彼自身が決定権を行使することはほとんどない。 豪放な性格であるがカリスマ性も高く、国民からの信頼は絶大である。 彼の先祖はかつてのシャルバロン危機で討死している。 かつては現アヴィエラ銀河系のディガス大使長であるオルジェに師事しており、今なおオルジェを師匠として強く慕っている。 また、スペリオーグ機動団所属の同族、ゼルカール・フェンディムは盟友の一人である。 デザイン・プロフィール：元々惑星クラゴメーアを考案したのが「ロトの紋章」の海の王国を見た際であるため、海をまとめる王が人間型であるのはほぼ決めており、その王として考えたのが彼である。モチーフと言うほどではないが、同作の海王リバイアサンやシーザリオン等がイメージに影響しているのは間違いないだろう。 名前は、みなみのうお座、フォーマルハウトから関連する用語を適度にもじっている。 △メニュー 項目変更 この項目が面白かったなら……＼ポチッと/ 名前 コメント -GDW世界 白銀の賢者分室 GDW メインページ
https://w.atwiki.jp/popwiki/pages/33.html
いらっしゃい ぐいぐいぐぐーい… しょいきーすーきー… せんせー、せんせー… それはいわゆる粗相 どどどドキんちゃん… なーんで持ってるの？… 飲んでますかー、飲んでますかー… ビッグマン 一つ一人でするイッキは… ビンダビンダ… ○○飲むー、○○飲まない… ラブ、ラブ、ラブドッキュン
https://w.atwiki.jp/magicman/pages/15078.html
親衛隊員 コール男 C 闇文明 3 クリーチャー：ヘドリアン 2000 ■ブロッカー ■このクリーチャーは攻撃することができない。 ■このクリーチャーが破壊された時、相手の手札を1枚見ないで選び、捨てさせる。 作者：宇和島 コモンの親衛隊サイクル 《親衛隊の使徒カーラ・テープ》? 《アクア親衛隊 エスエス》 《親衛隊員 コール男》 《親衛隊のエグゼドライブ》 《親衛隊員 青銅の光筆》 フレーバーテキスト L・O・V・E！L・O・V・E！あ・い・し・て・る！--コール男と親衛隊 評価 名前 コメント