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老い / 働く高齢者 / 高齢者筋トレ / 高齢者医療 / 後期高齢者 / ワクチンと高齢者 / COVID-19ワクチンと高齢者 / 少子高齢化 / 老人保健 / 老人道 / 終末期医療 / 高齢者施設 / 高齢者はさっさと... / 高齢者給付金・助成金 / 高齢者がいる社会 ※日本人高齢者が中国で日本と同様の介護サービスを受けられる5カ年計画 ※高齢者雇用:65歳まで再雇用義務化 希望者全員、法改正目指す--厚労省 ■ ハーバード大が突き止めた「年をとるほど脳が活性化する条件」山上勝義 「るいネット(20/10/20 PM07)」より / ■言語力、空間推論力など、4種で高齢者が優る 「年をとれば物覚えが悪くなり、頭の働きが鈍くなるのは仕方ない」という既成概念を覆し、人の脳には加齢に抗する底力があることが近年の脳研究で明らかになってきた。脳は高齢になっても可塑性(自分とその周辺の状況に応じて変化する能力)を維持し、誰もが加齢に従って認知力の低下を体験するとは限らない。逆に中年以降に高まる能力もあるということなのだ。 研究者に加齢と脳の関係を再考させるきっかけとなったのは、約5000人を対象に加齢による脳の様々な変化を半世紀以上も追跡調査してきたワシントン大学の「シアトル縦断研究」。認知力を測る6種のテスト中4種で、高齢者の成績は20代よりも良かった。記憶力と認知のスピードには加齢に伴う低下が見られたが、言語力、空間推論力、単純計算力と抽象的推論力は向上していた。この研究は加齢による記憶力の低下には個人差が大きいことも明らかにした。被験者の15%は高齢になってからのほうが若いときより記憶力が優れていたのだ。 ■40歳から69歳のパイロットの認知力を比較 (k※mono....以下略、詳細はサイト記事で) .
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じゅばく【登録タグ し デフォ子 ニコニコ外公開曲 全てあなたの所以です。 曲 曲さ行】 作詞:全てあなたの所以です。 作曲:全てあなたの所以です。 編曲:全てあなたの所以です。 唄:デフォ子 曲紹介 全てあなたの所為です。氏の「教育」の模倣。 プレイリスト「大問1」に収録。 歌詞 (動画より書き起こし) 本日は に御アクセスいただき、 誠にありがとうございます。 大変申し訳ありませんが、 この動画はアップロード者が した為、 ご覧になることができません。 またの御アクセスをお待ちしております。 若しくは、 未知数の形をした偽物が、 紙面上の反応を 為そうとしたとか。 若しくは、 終止符の形をした贋作が、 より大きな物体を 作り上げたとか。 若しくは、 卵型に似た無色の虚無感は、 原始点なる奈落に 引き摺り込むとか。 若しくは、 縮小して積み上げた乳飲み子は、 二次的アポカリプスを 計画するとか。 記憶、 白紙、 延長、 挫折、 幸不幸の移ろいは、 屹度変化を齎すのか? 凍てついた片の眼、 歪められた重力と、 無数の平仮名が 脳髄を蝕みました。 嘆くトライポフォビア、 忘れられない永久の令書、 教育者に呪われた謌に 我々は傀儡となっていた。 或いは、 スクエアが繋がれた空箱から、 非可塑性の真実を 注いでいたとか。 或いは、 三つ色の国なる蓼食う虫も、 留めの無い詠唱を 騙っていたとか。 あなたは誰ですか? 私は此処に居ませんが、 身を滅ぼして、 私ではない何かを。 細胞と波の字を、 一思いに葬って、 愛しみ続けていた、 唯それだけの事で。 欠如、 烙印、 邂逅、 約束、 摺り替え無為に帰した部屋、 誰も入らずに。 凍てついた片の眼、 風前の灯では、 積み上げた虚無を顧みても 既に手遅れで。 靡く方眼の旗、 不文律なる詠唱、 弊履の端を見間違えた者の 両足は切り落とされていた。 途切れていた、 廃れていた、 コメント 名前 コメント
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素材を切るための工具の一覧です。 アイコン説明/金属加工 木材加工 ガラス加工 革・布加工 石材加工 プラ・樹脂加工 鋸(のこぎり、のこ) 木材や金属を切断するための手工具。金属製の板の端に設けられた多くの刃(歯・目)で、押したり引いたりを繰り返すことで切る。加工法や用途、素材によって形状や材質は様々に用意されている。 プライヤ 説明文 カッターナイフ 主に紙やボード類を切るための手工具。刃先を素材に当てがい引く様にして使用する。切れ味の持続を目的に、切れなくなった刃先を折って新しい刃先にできるのが最大の特徴。加工法や用途、素材によって形状や材質は様々に用意されている。 はさみ、ハサミ、鋏 説明文 はさみ 裁ちばさみ、裁縫ばさみ 金切ばさみ、金切鋏 枝切りばさみ 万能はさみ デザインナイフ 説明文 円切りカッター、サークルカッター 主に紙やボード類に正円の穴をあけたり切り取る手工具。素材に軸を当てがい刃や素材を回転させて切る。 ロータリーカッター 主に紙や布を大まかな曲線で切る手工具。円板状の刃を転がし素材を押し切る。 切出し小刀 説明文 Pカッター 主にアクリル板や塩ビ板などの樹脂製薄板を切る手工具。素材に対して引っ掻く様に筋彫りを行ない使用する。 スチロールカッター、ヒートカッター 主に熱可塑性の樹脂発泡材(発泡スチロール、ウレタンフォーム等)を切る工具。ニクロム線などの鉄線材に電気を流し、その抵抗で生まれた熱で素材を溶かして切る。手に持って使用するものと、卓上に置いて使用するものがある。 昇降盤 説明文 丸ノコ盤 説明文 横切り盤 説明文 パネルソー 説明文 バンドソー 説明文 糸鋸盤、糸のこ盤 説明文 丸ノコ、マルノコ、丸のこ 説明文 スライドマルノコ 説明文 ペンチ 説明文 ラジオペンチ 説明文 ニッパー 説明文 パイプカッター 説明文 超音波カッター 説明文 シャーリング 説明文 シャー 説明文 ハンド二ブラ 説明文 裁断機 説明文 プロッター 説明文 ワイヤーカッター 説明文 ワイヤーストリッパー 説明文 高速切断機 説明文
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【検索用 しゅはく 登録タグ UTAU し デフォ子 ニコニコ外公開曲 全てあなたの所以です。 曲 曲さ】 + 目次 目次 曲紹介 歌詞 コメント 作詞:全てあなたの所以です。 作曲:全てあなたの所以です。 編曲:全てあなたの所以です。 唄:デフォ子 曲紹介 曲名:『呪縛』(じゅばく) 全てあなたの所為です。氏の「教育」の模倣。 プレイリスト「大問1」に収録。 歌詞 (動画より書き起こし) 本日は に御アクセスいただき、 誠にありがとうございます。 大変申し訳ありませんが、 この動画はアップロード者が した為、 ご覧になることができません。 またの御アクセスをお待ちしております。 若しくは、 未知数の形をした偽物が、 紙面上の反応を 為そうとしたとか。 若しくは、 終止符の形をした贋作が、 より大きな物体を 作り上げたとか。 若しくは、 卵型に似た無色の虚無感は、 原始点なる奈落に 引き摺り込むとか。 若しくは、 縮小して積み上げた乳飲み子は、 二次的アポカリプスを 計画するとか。 記憶、 白紙、 延長、 挫折、 幸不幸の移ろいは、 屹度変化を齎すのか? 凍てついた片の眼、 歪められた重力と、 無数の平仮名が 脳髄を蝕みました。 嘆くトライポフォビア、 忘れられない永久の令書、 教育者に呪われた謌に 我々は傀儡となっていた。 或いは、 スクエアが繋がれた空箱から、 非可塑性の真実を 注いでいたとか。 或いは、 三つ色の国なる蓼食う虫も、 留めの無い詠唱を 騙っていたとか。 あなたは誰ですか? 私は此処に居ませんが、 身を滅ぼして、 私ではない何かを。 細胞と波の字を、 一思いに葬って、 愛しみ続けていた、 唯それだけの事で。 欠如、 烙印、 邂逅、 約束、 摺り替え無為に帰した部屋、 誰も入らずに。 凍てついた片の眼、 風前の灯では、 積み上げた虚無を顧みても 既に手遅れで。 靡く方眼の旗、 不文律なる詠唱、 弊履の端を見間違えた者の 両足は切り落とされていた。 途切れていた、 廃れていた、 コメント 名前 コメント
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図画工作 ~彫刻~ ◎彫刻刀は利き手で(鉛筆)を持つようにして握り、反対の手の人差し指を彫刻刀の(刃)の部分において、刃の動きを調節しながら彫る。 切り出し刀・・・細かい溝、輪郭、文字 平刀・・・・・・浅く平らに彫れる、不要な部分、ぼかし 丸刀・・・・・・太い線、柔らかい線、広い部分≪柔らかい雰囲気≫ 三角刀・・・・・鋭く細い線、細かな部分、輪郭、力次第で線の太さを調節できる 彫刻には木や石などの固形材料を外から彫り刻む(彫造(カービング))と、粘土や石膏などの可塑性のある材料を中心から外側に付け加えたり、型に流し込んだりして形にする(塑造(モデリング))という2種類の方法がある。 また、完全な立体であらゆる方向から鑑賞できる彫刻を(丸彫り)といい、半立体で正面からのみ鑑賞できるものを(レリーフ(浮き彫り))という。後者は丸彫りと絵画の両方の要素を持ち、光のあたる方向によって明暗の美しさをもつ。 塑造につかう粘土は(油粘土)と(紙粘土)がある。粘土は初めに水分を加えたり粘土板に広げ、(粒子)が均一になるようによく練る。そして(耳たぶ)程度の固さにする。硬くなった粘土はできるだけ(細かく粉末状)にした後、(水)を少しずつ加えて小さなかたまりにして(ビニール袋)に入れて保管する。また、余った粘土を保管する際には乾燥しないように(固く絞った布)でくるみ、ビニール袋でしっかり包む。また、石膏は湿気を吸いやすく、湿気を吸ったものは(固まらなくなる)ので、ビニール袋に入れて封をしっかりとして保管する。古い石膏を使う場合は少量を水で溶き、固まるか確かめてから使用する。 粘土による塑像の制作は①スケッチをする②心棒づくり(骨組みをし、水でぬらした(麻ひも)でしっかりと巻く)③肉付け④仕上げという過程で行う。(テラコッタ)は作品を1~2週間日陰干しにして完全に乾燥させたもので厚くなる部分は内部をくりぬいて薄くし、約(800)℃で焼成するのが基本である。 彫刻
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マジカニア人の乳房について 卵胎生の甲殻類であるマジカニア人が乳房を持つことを奇異に感じる者も多いだろう。 実際、マジカニア人は授乳を行わず、第I期幼生の主食は、魚のすり身やプランクトンを水に溶いたペースト状食品が一般的だ。 もちろん乳腺も存在しない。 それにもかかわらず、なぜ人類とほぼ同じ形態の乳房を持っているのであろうか。 これは、マジカニアの国土が四国程度の狭い島であることに原因がある。 限られた空間によって生息できるマジカニア人の数には限界がある。 これは、遺伝子的多様性を保つことの困難性を意味している。 解決策としてマジカニア人は異種交配による遺伝子の獲得を選択した。 これは魔法技術が確立されるよりも遥かに昔の出来事だが、元来魔法的な存在である原始のマジカニア人は大変うまくやった。 交配相手は甲殻類に留まらず、魚類、海棲哺乳類、昆虫類、鳥類など多岐にわたる。 だが、特殊な海流に阻まれ地中海に孤立するマジカニアに人類が訪れるにはまだ長い時を必要とした。 それ以前も数例の漂着はあったかもしれないが、マジカニア人と人類が初めて本格的に出逢ったのは、紀元前4千年頃、ようやく人類が船舶を地中海に漕ぎ出した時期である。 お互いに高度な文化を持ち、複雑な情緒を理解し合える人類は、遺伝子交配相手として望ましい種であった。 それ以来、人類以外との異種交配は徐々に頻度を減じてゆき、今では一部の好事家が伝統を守っているのみである。 人類のよりよきパートナーとなるために、マジカニア人は乳房を発達させてセックスアピールの向上に努めた。 魔法由来の遺伝的可塑性により、人類の特長をうまく取り入れてマジカニア人の乳房は順調に発達していった。 だが、長い生命の歴史から見て数千年は非常に短い期間である。 また、本来はマジカニア人にとって必要のない器官であるため淘汰圧も低い。 ゆえにマジカニア人は、今なお全国民がおしなべて貧乳なのである。 パルプの胸が今後飛躍的に成長する可能性は、極めて低いと言わざるを得ないだろう。
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Shoggoth 太古の地球に飛来した宇宙生物の一つである古のもの達によって無機物から作られた、泡立ち粘つく多細胞の原形質生物。 地下鉄の車両ほどに大きなタールでできたアメーバ。 非常に高い可塑性と延性を持ち、必要に応じて自在に形態を変化させ、さまざまな器官を発生させることができる。 何にでも変身可能で、建築物にでも人間にでもなれる。大きさは人間くらいの大きさから街一つ呑み込む程の大きさにまで変化出来る。 テレパシーが可能で、もともとテレパシーで使役されていた。 水陸両棲。 鳴き声は「テケリ・リ」("Tekeli-li")。主である「古のもの」の声を真似したとされる。 もともとは知性も低く、「古のもの」どもに肉体労働のための奴隷種族として使われていたが、発生させた脳を自ら固定化することで知能を持つようになり、創造主である「古のもの」に反抗して壊滅的な損害を与えた。併し最終的には地底に封印された。 現在はディープワンや幾つかの旧支配者の奴隷として使われている(ツァトゥグァのペットになっているものもいたが、人間に盗まれた)他、南極にある古のものの都市の廃墟には野生化したものが棲んでいる。 ネクロノミコンの中に召喚手順が書かれており、召喚されると自動的に召喚者を主と認識し、脳波を記憶するが、主とそれ以外の個体の区別はおそらく脳波によるものと想われる。 女子大生に召喚されマリリン・モンローに変身させられて町を歩いたり、バーバレラの時のジェーン・フォンダに変身させられたりした個体もいる。 一応の自我は備えており、主が「じっとしていろ」と指示するのを忘れて町の近くに待たせておいた個体が大きくなって町を呑み込んでしまった、というケースもある。 イメージとしては横山光輝のバビル2世に登場する不定形の変身生物ロデムで能力や特徴は一緒。 初出はハワード・フィリップス・ラヴクラフトの「狂気の山脈にて」。
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喫茶店の訓練所。 飯窪春菜は正面に据え置かれた姿見の前で、くねくねと妙なポーズを取っていた。 決して、ふざけているわけではない。 田中さんは新しく結成された能力者のチームに合流してしまわれた。 もう、あたしたちはリゾナンターの主力にならないといけない。 春菜の気合を現すかのように、背後から黄色い液体が噴出する。 春菜の能力「粘液放出(アドヒア・セクレイト)」だ。 ついこの前まで、ただの汗っかきの能力として、同僚からも何となく白い目で見られていたような気さえする この能力。しかし、つい先日のダークネスが差し向けた戦闘員との戦いで、彼女は発見した。 この黄色い妙な液体は、春菜の意思により硬化することができる。 それだけではない。ある程度は動かしたりすることもできる。 そこで春菜は思いついた。 こッ、この動きッ!そして自由な可塑性ッッ!!!まさに…スタンドそのもの!!!! スタンドとは、春菜の愛読書であるバトルマンガに登場する能力のこと。 その能力と実際に春菜が保有している能力の共通点に春菜は気付いたのだった。 試しに、彼女は鏡に向かって大きく叫ぶ。 「出でよ、スタープラチナッ!!!」 叫び声とともに、黄色い液体が人の形を成す。 それでは物足りないのか、春菜はズッギュウウウウウンッ!と自分の口で効果音を発する。 こうなるともう彼女を止めることはできない。 「やれやれだぜ」 「「悪」とは てめー自身のためだけに弱者を利用し ふみつけるやつのことだ!!」 「てめーは俺を怒らせた」 体をくねらせながら意味不明の台詞を呟く春菜。彼女は完全に自分だけの世界に入っていた。 「はるなん…今日はいつもに増してきもいね」 「見なかった、見なかったことに」 「さーてハルはあっちでも自主練すっかな」 先輩や同僚の白い目もなんのその。 今日も飯窪春菜は自らの能力の限界に挑戦するのであった。 投稿日:2013/08/09(金) 23 48 50.17 0
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質問対策 だいたいこんなもの? こんなかんじ。 こんなかんじ。 FLIMに最低限必要なこととは? 1.80MHzのパルスレーザー 2.高感度の光電子増倍管 3.ナノ秒オーダーで蛍光寿命を取得するハードウェア 脂質とプローブの関係はどうなっているのか? 普通培養細胞は、1plくらいだと考えられています。 スパインの中は0.1flから0.01flくらい 大体、100倍くらいだと考えられます。 大体、DAGは、1fモルです。一細胞に。 だから、10あぷとモルくらいある。(この計算はおかしい。神経の場合、スパインは特別だと考えられる) PIP3の場合は、その100倍くらい少ないから。100ゼプト盛るくらいあります。これが、刺激によって10倍くらいに変わるといわれています。 脂質プローブと脂質の結合能は、かなり高いですから、始めから結合していると考えられます。ここで、刺激が加わると、破壊分析の結果などを参考にしますと10倍から最大で50倍くらいの脂質ができます。これに、プローブが反応して応答するということになります。これは、プローブ全部を応答させるための量く シグナル伝達に関わるタンパク質は、タンパク質は、数十個あると言われている。よって、それに応答するPIP3も同様にそのレベルあるのではないかと推測します。プローブ分子は膜タンパク質で、蛍光を見ればわかるとおり、極めて量は少ないです。タンパク質の発現量は10-6Mくらいですから、スパインの容量が0.01flくらいだとすると、大体数十個くらいあると考えられます。よって、PIP3、プローブが大体数十個くらいずつあると想定してもらえれば大丈夫です。普通のPMTではなく、Gasp detectorを用いて観測しております。 1. In this presentation, you don t mention SHIP protein. How do you think SHIP protein is involved in this pathway? Thank you very much for good question. Exactly, SHIP is the protein that degrades PIP3 to PI(3,4)P2. I did not examine the effect of SHIP on spinule formation. Some paper shows that SHIP is not expressed in HP. Anyway it is very interesting to know the effect of SHIP on spinule formation. 1.0 How did you analyze spinule formation? It is pretty difficult that as you know spinule is very fine structure. So it is pretty difficult to observed. In our study we used the hamahoto H7422 Gasp detector. Spinules that protruded from the spine head were counted. Each synaptic spinule, regardness of its size and orientation, was scored as in previous studies (Tao-Cheng et al., 2009) And we did analyze the circularity. The effect of PTEN inhibitor, which increses PIP3, reduced the circularity. In the case of PI3K inhibitor, which decreases PIP3, there was the tendency that circularity increases but no significant difference. 1. 1. PIP3 or PIP2? very good question. This study is in the middle of revise. Reviewer pointed out about this point. I am looking for the protein of downstream of PIP3 such as Akt protein. And basically PIP2 is 100 times more than PIP3. even though PIP3 increase or decreases, PIP2 level is not reflected. So I think that PIP3 is the factor to regulate spinule formation. 1. 2. The relationship between schizophronia and PIP3 Inositol metabolism is deeply related to the depression and bipolar disorder. Because old days drug lithium is well known to work this pathway. currently it seems that lithium effects the GSK3beta. And PTEN mutant causes coden disease, which is accompanied by sometime mental reterdation. So PIP3 and inositol metabolism is related to the disease like these. But I think there is mainly two cause inositol metabolism regulates such a diseases. One is that PIP3 regulates the neuronal development in develop brains. The other is synapse function after neuron grown up. In the present study, I examined the effect of PIP3 on spine morphology. In near future, I want to examine the effect of PIP3 on neuron development. In some part, Dr. sheng reveal that PIP3 regulates the dendritic arborization though. 1.3 How about the mobility of PIP3 側方拡散lateral diffusion is roughly 1 microm/sec. But Dr. Kusumi shows that there is some barria mechanism which prevent the lateral diffusion of lipids. The molecules is surrounded by the fenses the size is 30 to 200 nm. So we cannot say that PIP3 is easily do the lateral diffusion. 1.4 PIP3 and raft Basically PIP3 fatty acid composition is steroyl and arachidonyl. 1.5 Did you try RNAi for PI3K and PTEN I tried PTEN RNAi. But I don t analyzed yet. 1.6 Did you check the decrease in PIP3 in the presence of PI3K inihibitor? Yes, I did it. I observed PIP3 reduction and increase in the presense of PI3K and PTEN inhibitor respectively in this figure. In the presence of PI3K inhibitor, PIP3 decrease more in spine than dendritic shaft. In the presence of PTEN inihibitor, PIP3 increase more in dendritic shaft than spines. Previously several paper shows that PTEN is localize in the dendritic shaft. Also some paper showed that PI3K is localized in spines and dendrites, but PI3K directly binds to AMPA receptors, leadting to PI3K activation. This data answers that why PIP3 is accumulated in the spines. 2. In the middle of glutamate uncaging, is PTEN related to this decrease? At first, I expect that PIP3 decrease during glutamate ungaging is due to PTEN. But I examined the effect of PTEN inhibitor on PIP3 decrease during glutatate uncaging. There is no obvious difference with or without PTEN inhibitor about PIP3 decrease. So I think this decrease of PIP3 is mainly due to menbrane insertion. 3. PTEN is dual phosphatase? Did you remove the possiblility PTEN phosphatase activity works in this pathway? Exactly PTEN has dual phosphatase activities. burabura. 4. PIP3 is involved in the functional plasticity? and structural plasticity? As I showd in introduction, there is no doubt that PIP3 regulates functional plasticity. 5. Does PIP3 regulate spinule length? Actually PIP3 regulates the number of spinule. But the length of spinule is not regulated by PIP3. 6. Explain the FLIM more. 7. What is the strength of FLIM compared to FRET? Previously I developed the ratiometric FRET probes including PIP3 and DAG probes. In the case of ratiometric-based FRET probe, in the thick tissues like hippocampal slice, wave-dependent fluorescence absorabance is gonna happen. We cannot measure appropriate FRET efficiecy. So I newly developed the florescence lifetime-based probe. Fluorescence lifetime never change even though thick tissues. That is the strength of FLIM. 8. PI3K works in the middle of glutamate uncaging? I did the experiment to see the effect of PI3K inhibitor on PIP3 concentration during glutamate uncaging. But there is no significant difference between with or without PI3K inhibitor. This means that enzymatic induced PIP3 is extremely little compared to dilution of PIP3 which is caused by membrane insertion. But if we want to observe more detail PIP3 dynamics which is caused by the PI3K or PTEN during glutamate uncaging, I plan to do this experiment as follows. At first I make the situation that spine size doesn t change even during glutamate uncaging using cytokarasin and catrunculin, which is inhibitor for actin polymerization. In this situation I am gonna measure the PIP3 increase or decerase. So I can observe real PIP3 change not induced by membrane insertion. 9. What is the down stream pathway of spinule formation? 10. What is the most difficult point for this work? How did you take over this problem? 11. What number of PIP3 is there in spine? Rough caluculation is 10-100 number of PIP3. How about the number and length of spinule ? raft and PIP3. my probe is subjected with palmitoyl and farnesyl modification. Recently raft proteins clustering regulate the localization of N-Ras. At least I get the response of FLIMPA3 in culture and neurons. The important proteins including PI3K is localized in raft. So PIP3 also localized in raft. But it is very interesting to discriminate the PIP3 production or reduction in raft or non-raft. 神経細胞の樹状突起には約1万個のシナプス結合があります。人が記憶する前と後で、脳の中で何かが変わっているはずです。実際、シナプスで電気の通り方などが変化することから、この一つ一つのシナプスは記憶の最小素子だと考えられています。故に、個々のシナプスの特徴を知ることは、記憶のメカニズムを探る上でとても重要です。個々のシナプスは、入力をうける神経細胞から別々に入力を受けるので、独立に働いていると考えられる一方、クロストークという減少もあります。これは、一つのシナプスに入力が起きたときに、隣接するシナプスに影響を及ぼし、隣接するシナプスで入力を受けやするするということであります。 スパインがクロストークすることはどのような意義があるのでしょうか?りんごというものを覚えたとしましょう。そのときにあるシナプスが活性化し、その付近のシナプスとクロストークします。そのときに、りんごの性質、あかい、おいしいなどの情報が近くに入力しやすくなれば、今度思い出すときに、効率がよいと考えられる。シナプス間のクロストークは、このような思考の分子レベルでのモデルとなるのではないか?と考えております。 クロストークを引き起こす因子として、従来からいろいろな因子が報告されてきました。一酸化窒素、アラキドノイルグリセロールなどの因子は、細胞膜を超えて、隣のシナプスのシナプス前膜に作用するなどの報告がありました。2007年にラスたんぱく質が樹状突起を通って、隣のシナプスに作用することが報告されました。私は、このシナプス間のクロストークに関わる因子の一つとして、脂質シグナルがあるのではないかと考えました。脂質シグナルは、シナプス前膜からグルタミン酸が放出されるとシナプス後膜のグルタミン酸受容体が活性化し、PIP2からホスホリパーゼCによって、DAG,PI3KによってPIP3が産生されます。DAGは、神経細胞の分化などに関わるシグナル、PIP3は、アポトーシスに関わるシグナルを制御することが知られています。 脂質シグナルだと考える根拠は、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置すること、特にPIP3は、グルタミン酸などの刺激入力を受けた後、分解されずに数時間持続することが知られ、1秒間に0.5マイクロメートル側方拡散され、隣接するシナプスに到着することができるからです。この結果、この脂質シグナルが、隣接するシナプスに移動し、隣接するシナプスに入力を受けやすくなるのではないかと考えました。 では、どうやってこの脂質シグナルを測るかですが、従来までの脂質シグナルの測定法は、破壊分析に頼っていたために、一個一個のシナプスの個性を失っていました。そこで、生きた神経細胞で見るために、私が現在までに開発したFRETプローブ分子を用いようと考えております。このプローブの特徴は、2つあります。1つは、脂質結合ドメインを変えることによって、様々な脂質を見ることができること。従来までに、DAGおよびPIP3のプローブを作ってきました。2つ目は膜に局在していることです。従来までに、脂質を見るためのプローブ分子として、GFPと脂質結合たんぱく質の融合プローブがよく使用されている。脂質が細胞膜で増加した際、プローブ分子が膜に移行することによって増加を確認できる。しかしながら、スパインおよび樹状突起は細胞体とつながっており、脂質プローブがスパインまたは樹状突起の膜に移動した際、細胞体にあるプローブがスパインに流れ込み、バックグランドのノイズとなる。申請者のプローブ分子は、膜に局在しているために、バックグランドがないため、スパインおよび樹状突起での脂質の動態を見るために優れている。これは、脂質シグナルをシナプスにおいて観察することができる能力を有しております。 実験においては、この作製した脂質FRETプローブを海馬スライスに遺伝子銃によってトランスフェクションします。次に、詳細は省きますが、自作の2光子顕微鏡を用いて、神経細胞を観察します。図のように樹状突起およびスパインが観察されます。 次に、プローブを発現した神経細胞のひとつのシナプスを刺激します。顕微鏡下で、神経細胞はこのように観察されます。2004年にひとつのシナプスを刺激する方法が開発されました。まず、グルタミン酸前駆体をインキュベートします。一つのシナプスの近傍に光刺激を行うと、この限られた範囲でグルタミン酸が産生され、シナプスが刺激されます。これによって、脂質のシグナルがどのように起きるのかを観察します。また、図を観察すると刺激を受けたスパインだけ大きさが大きくなっていることがわかります。シナプスはある一定以上の強さの入力を受けることで、このように大きさを変えます。これは、このシナプスがこの入力を記憶したということを示しています。申請先研究室では、このシステムをいち早く取り入れ、80%以上の確率でシナプスサイズを変えることが可能であります。 そこで、一年目では、2光子顕微鏡のセットアップを行う。それと同時に、PIP2,DAG,PIP3のプローブ分子をFLIMプローブに変える。 2年目では、一つのシナプスを刺激し、脂質シグナルがどの程度、どのくらい樹状突起まで伸びていくのかなどの、基本的な情報を得ます。時間的には、グルタミン酸産生に伴い脂質シグナルが活性化しPIP2は、基質であるために、減少し、DAGおよびPIP3は増加すると考えられます。しかしながら、DAGは破壊分析の結果から一過性、PIP3は、持続すると期待できます。 2年目は、脂質シグナルが届くシナプスと届かないシナプスに刺激を与え、光刺激がどの程度の刺激の強さで、スパインの大きさが変わるかを調べます。 脂質シグナルが届く範囲のスパインは、より弱い光刺激で大きくなるのではないかと期待します。 次に、脂質の移動を止めるために、セプチンたんぱく質を強制発現します。発現します。このたんぱく質は、図のようにスパインネックに発現します。緑がGFPセプチン、赤は神経細胞の形状のマーカーです。セプチンは3nmほどのたんぱく質でこれらがオリゴマーを形成し、スパイン脂質の移動を阻害します。この状態で、一つのシナプスを刺激します。すると脂質の移動は阻害されますから、隣接するスパインの大きさの変わり方は、遠くのシナプスと変わらないのではないかと推測できます。 この実験によって、脂質シグナルがシナプスのクロストークに必要であるかを検証します。 本研究では、 申請者が現在までに培ってきた脂質の知識 および蛍光プローブ分子を現所属研究室に導入する 現研究室にある2光子顕微鏡グルタミン酸光分解システムを用いる。 スパインにグルタミン酸刺激を与えたときに、 脂質分子のスパイン内および樹状突起上での広がりを観察する 脂質分子の移動を阻害することで、脂質シグナルが、隣接するシナプスにどのように影響を及ぼすのかを探っていく MIT時代には何をやってきたのですか? クロストークをとめたら連想がとまった。 脂質シグナルをとめたら連想することができなくなった。 個々のシナプスで引き起こされるシグナルは、シナプス内で留まることも予想されるが、近年、一つのスパインの変化が、隣接するスパインに影響を及ぼすことが報告されている 従来までのシナプスでのシグナル伝達を調べる方法としては、シグナル伝達の阻害剤と電気生理的手法を用いた結果が主であり、一万個存在するシナプスの総和から得られた情報である。 How much does enlargement of spine happen? How much does lipid second messenger is there? Is it right to tell lipid signaling as controller of signal? What is the function of septin? Septin is discovered in1971 in budding yeast mutants defective in cell-cycle progression. If you overexpress the septin, not only lipids but also the protein, which localize in membrane, is stopped by the septin, right? I need to prepare the septin, which have mutant ATP binding site or mutant enzyme activity delation mutant. You should learn the mechanism the pathway until producing lipid second messenger. ラフトによって、もっと上流のたんぱく質は動くことがないのではないか? Gたんぱく質はそるブルだから大丈夫。しかし、Gbrは膜局在型。代謝型グルタミン酸受容体はどのGたんぱく質を活性化するのか?また、PLCデルタ、PLCβは泳ぐが大丈夫か? 脂質の組成がミックスしないようにたんぱく質がバリアを作っているということは結構ある。らてらるとばそらてらる。 でんどらいとにのみ発現しているようなたんぱく質はないだろうか? What size is lipid? ゴーシュ型でC-C 1.513; C-H 1.112 Å アンチ型でC-C 1.511C-H 1.112 Å 大体DAGは5Å, 10Å PIP3は10Å, 10Å PTEN, DGKをノックアウトしたらどのくらいまで伸びるのか? どれくらい脂質は産生するの? 本当に脂質はシグナルの司令塔なの? 西塚先生を出す。 デイビッドホロビンを出す。 脂質って細胞膜からどれくらい出ているのか?PIP3だったら15nm以上は出ていると思う。 もし、始めから脂質の移動が阻害されていたらどうする? 確かに、CaMkIIはスパインでのみ活性化されることが知られている。 しかし、Rasは結構長く伸びることが知られている。 脂質の移動を阻害するものの有力なものとして、セプチンがあげられるのですが、エンドジーニアスなセプチンもあります。ただ、結構、すべてのスパインネックに存在しているわけではなく、もしかしたら、脂質の移動を変えるような働きをしている可能性があります。クロストークに選択性があるということでとても面白いということになります。 脂質シグナルをスパインで見ることの重要性。 何故、スパインが記憶の最小素子となるのか? 何故あなたは脂質シグナリングを選んだのか? 1.脂質シグナルは移動することができるシグナルの最上流である。 2.脂質シグナルの特にPIP3シグナリングはしばらくの間持続する。 PKCの局在を見てみるとデンドライトでも起きている。やっぱり脂質は移動していると考えられる。 実は、かれるによって、らすシグナルが閾値の上昇に必要だということがわかっている。しかしながら、何故ラスなのか?実は、ラスはPIP3の下流なんですよね。 PTENの局在。 DGKの局在。DGKはカルシウムによって活性化されるが、神経細胞でのカルシウムの上昇は瞬時である。 これによって、あるシグナルに反応しやすくなるようになり、ある反応に応答するシナプスクラスターができるのではないだろうか。 シナプスのクロストークに脂質シグナリングが関係していなかったら? 脂質修飾のメカニズムについて。 PIP2の局在は?下の論文にあるように恐らく均一に存在する。 しかし、結局のところ活性化されたグルタミン酸受容体がどこにあるかが重要でさらに、活性化したPI3KとPLCがどこにあるかによる。 Neuroscience Letters 423 (2007) 158–161 もしかするとPLCやPI3Kがデンドライトまで泳いでいって、PIP2を代謝することはないのか? 恐らくないと思う。その根拠は、代謝型グルタミン酸によって活性化されるPI3Kはp110rだと考えられます。 このたんぱく質は、脂質修飾を受けているたんぱく質とコンプレックスを作っている。 もしかしたら他の脂質修飾されていないようなたんぱく質がPIP3を作る可能性があるかもしれないよ。 そしたら、それは、わかりません。ただ、ここで重要なのは、PIP3ができて、それが樹状突起を移っていくことが観察できればいいのだと考えております。 PI3kは1,2,3型が存在する。そのうちPIP2を基質とするものは、I型だけである。一般的なI型のA型は、チロシンリン酸型受容体によって、活性化される。一方、I型のB型は、p110γであり、これは、Gたんぱく質共役型受容体によって活性化される。Brとアダプターたんぱく質のp101と複合体を形成する。このため、かなり移動度が遅いと考えられる。よって、PIP3のような低分子の方がかなり早く動けるのではないかと考えております。 よって、PIP3の量は、PTENとPI3Kのバランスで決まっている。しかし、 PIP3を作り出す刺激は、グルタミン酸受容体だけなの? いえ、恐らく他にもあるとかんがえられます。しかしながら、今回絞っているのはグルタミン酸受容体だけです。 DGKはどこにいるの?細胞質中にいますが、DGKは、9つのアイソフォームがあって、α、βは、PSD結合ドメインを持っていないが、γ、ζはもっている。基本的に、デンドライトシナプスにいるが、後者は、PSDに濃縮されている可能性もある。 別にあなたのプローブじゃなくてもサイトゾルプローブで赤と緑比較してできるんじゃないの? 実は、それでは難しいです。というのは、仮に、フレットプローブと膜局在プローブが培養細胞などで100%応答した場合どちらも、最高の状態となります。しかし、神経細胞においては、デンドライトと繋がっていますから、さらに、プローブが入ってしまうわけです。すると、膜局在方はこの赤と緑がバックグランドとなって、感度が小さくなってしまうということがあげられます。よって、FRETプローブの方が応答はよいであろうと考えら得ます。 mGluRによって活性化されるPI3Kとして、IB型が挙げられる。これは、Gbrによって活性化される。 ちなみに、NMDA依存的にPIP2が減少する系も存在する。これには、2つの可能性が挙げられる。PLCが泳いでいった。もしくは、樹上突起にも受容体が多少なりとも存在し、それが活性化した。しかし、今調べたいのは、スパインから産生された脂質分子であるから系が全く違うと考えられる。 PIP3は、様々な方法で産生されると考えられる。スパインにはチロシンキナーゼ受容体EPH受容体なども存在するだろう。だから、PIP3が産生されるメカニズムはたくさんあると考えられる。しかしながら、今回はグルタミン酸受容体を考えているからそれによって活性化されるのは、代謝型グルタミン酸受容体だと考えられる。 もしかすると、brが移動するかもしれない。しかしながら、脂質とGたんぱく質どっちが移動が早いかというと、grの方が大きいから移動しづらいと考えられる。 Rasの活性化は、11microm//4 minである。とても遅い。結局、上流のシグナルがどうなっているかについての情報は何も与えないことになる。 クロストークを行うと何がいいのか? スパインネックが見えないんだけれどどういうこと?本当にくっついているの? 何分後に刺激をするの? どんな点が困難だと考えられるのか? 逆に、スパインで制限されたらどうするの? 答。もちろん計画を立てるときには一番面白い作業仮説をたてるわけであります。それはそれで面白いと考えられる。その一つとしてセプチンが上げられます。 普段から脂質はセプチンによって抑えられているんじゃないの? セプチンは、細胞質のたんぱく質の拡散も防ぐんじゃないの? それは、GFPを発現させてホトブリーチすればよい。 それを調べるためには、セプチンRFPを発現させて本当にセプチンが阻害するかを調べればよい。 スパインの大きさってどれくらい? シナプスのクロストークにプラスマイナスはあるのか? タイトルはゴシックにする。 申請者の利点はちょっと変えるべき。 何故FRETを使うか?理由を述べる、 脂質シグナルをわからせる 10出たものが拡散してしまうと3になってしまう。それでよいのか? セプチンの情報 あるセプチンは、PIP2などとくっついて膜のbracingを起こす。Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Tanaka-Takiguchi Y, Kinoshita M, Takiguchi K. Curr Biol. 2009 Jan 27;19(2) 140-5. DiIは分裂溝を通る。 ただ、Dilは細胞膜の表面に入ることから表側である可能性が高い。 細胞膜の成分をミックスしないで、そのまま分けるという役割を持っているたんぱく質の一つにセプチンというたんぱく質があります。セプチンは、主に細胞分裂の際に分裂溝にセプチンリングを形成し、細胞分裂に必要なたんぱく質です。また、細胞膜上の成分をミックスしないようにしているからです。 ですので、 スパインのコンパートメントについて カルシウムは、シナプスで制限される。 CaMKIIも同様に制限される。 しかしながら、Rasたんぱく質は制限されずに、クロストークに必要である、ただ、ラスたんぱく質は、カルシウムシグナリングによって活性化される。LY PTENの局在について 基本的に、PTEN is preferentially expressed in neurons and is especially evident in Purkinje neurons, olfactory mitral neurons, and large pyramidal neurons. To analyze the function of PTEN in neuronal differentiation シングルセルでは、核と細胞質中に存在することがわかっている。 1.神経細胞には、樹状突起上に約1万個のスパインがあります。人が記憶する前と後で、脳の中で何かが変わっているはずです。実際、このスパインは大きさをダイナミックに変えることから、一つ一つのスパインは記憶の最小単位だと考えられています。故に、個々のシナプスの特徴を知ることは、記憶のメカニズムを探る上でとても重要です。 2.神経細胞において、脂質シグナルは、記憶のモデルとなるシナプス可塑性と呼ばれる現象に必須であります。脂質シグナルは、シナプス前膜からグルタミン酸が放出されるとシナプス後膜のグルタミン酸受容体が活性化し、ホスファチジルイノシトール4,52リン酸、(PIP2)から(ジアシルグリセロール)DAG,ホスファチジルイノシトール3,4,53リン酸(PIP3)が産生されます。これらの脂質は、下流のたんぱく質を制御して、シナプス可塑性を引き起こします。 従来までの脂質の測定法は、破壊分析に頼っていたために、一個一個のシナプスの個性を失っていました。そこで、目的は、脂質シグナルを一つ一つのスパインで観察するということです。 3.申請者は、現在までに、蛍光共鳴移動FRETプローブ分子を開発しました。CFP, YFP, 脂質結合ドメインをαへリックスで連結します。プローブを膜局在シグナルで細胞膜に連結します。脂質が増えると脂質結合ドメインが結合し、グリシングリシンを中心にプローブが動き、CFPとYFPが近づきFRETが起きます。CFPとYFPの蛍光強度比から脂質の量を測定しました。培養細胞での脂質のそれぞれの膜での脂質の動態を明らかにしてくることによって、高い評価を得てきました。 4本研究では、直径1μmほどの微小空間での脂質の動態を調べることにチャレンジしてみようと考えております。直径1μmほどの微小空間においては、現在私の用いている蛍光強度比タイプのFRETプローブでは、YFPの光分解が激しく、蛍光強度比が一定しないという短所があります。そこで、蛍光寿命を測るためのプローブ分子に改良を行います。従来のプローブのCFPをGFPにYFPを蛍光を発しないYFPに変えます。蛍光寿命FRETプローブの特徴は、GFPの蛍光寿命で測定するために、GFPが光分解したとしても、ただ、蛍光強度がさがるだけで、蛍光寿命は変化しません。図のようにFRETが起きたときは蛍光寿命を表す直線の傾きが小さくなります。よって、微小空間でも精度の高いデータを取ることが可能となります。このFLIMを導入している研究施設は、世界でも3番目、日本ではうちが始めてです。 5.実験においては、この作製したFLIMプローブを海馬スライスに遺伝子銃によってトランスフェクションします。次に、詳細は省きますが、自作の2光子顕微鏡を用いて、神経細胞を観察します。 6.次に、プローブを発現した神経細胞の一つ一つのシナプスを刺激します。2004年に開発された、グルタミン酸アンケイジング法を用います。まず、グルタミン酸前駆体をインキュベートします。一つのシナプスの近傍に光刺激を行うと、この限られた範囲でグルタミン酸が産生され、シナプスが刺激されます。図を観察すると0分で刺激を受けた赤点のスパインが、大きくなっていることがわかります。シナプスはある一定以上の強さの入力を受けることで、このように大きさを変えます。これは、このシナプスがこの入力を記憶したということを示しています。申請先研究室では、このシステムをいち早く取り入れ、80%以上の確率でシナプスサイズを変えることが可能であります。本研究では、スパインの大きさを変えた際に脂質シグナルがどのように変化するのかを追っていきます。 7.一年目では、2光子顕微鏡のセットアップを行う。それと同時に、PIP2,DAG,PIP3のプローブ分子をFLIMプローブに変える。このプローブの特徴は、脂質結合ドメインを変えることによって、様々な脂質を見ることができることです。DAGのためにPKCC1Bドメイン、PIP3のために、GRP1のPHドメイン、PIP2のためにPLCデルタのPHドメインを結合してプローブを作製します。 2年目では、プローブ分子を発現させます。このプローブは、スパイン、樹状突起の細胞膜に局在します。グルタミン酸産生に伴い、基質であるPIP2は減少し、DAGおよびPIP3は増加すると考えられます。しかしながら、DAGは破壊分析の結果から一過性、PIP3は、持続すると期待できます。よって、空間的には、PIP3が樹状突起を移動していくのではないか?と推測します。 8.3年目は、樹状突起を進展する脂質シグナルが神経細胞の機能にどのように関わっているかを調べようと思っています。脂質シグナルは、隣接するスパインにも及ぶと考えられますから、何か、隣接するシナプスに影響を与えるのではないかと考えられシナプス間のクロストークなどを調べることがきるのではないかと考えます。例えば、近いスパインでは、遠いスパインに比べて、シナプス構造可塑性を引き起こすための、刺激の閾値が下がると期待できます。この際、樹状突起上に脂質の移動を阻害するようなたんぱく質を仕込むことで本当に脂質が関与しているかを調べようと考えております。 9.この研究において期待できること 現在、シナプスの入力へのパターンはわかっていません。クロストークが起きれば、Aいう入力やBという入力に対して、あるシナプスのクラスターができると考えられます。2007年にやっと、ラスたんぱく質のシグナリングがシナプス間のクロストークに関係することがわかるようになってきました。しかし、まだあまりにもわかっていることが少なすぎます。私の脂質の動態を明らかにすることで、脂質シグナルとシナプス間のクロストークの関係を明らかにし、記憶の基盤となる神経回路のパターンの解明を行う。 10. PIP3シグナリングは、1時間以上も続いているということ。これは、高頻度の電気刺激をおこなっってシナプス可塑性を誘導したときに、PIP3産生酵素PI3Kの阻害剤であるLY29を加えたときに、シナプス可塑性が阻害されるということからわかります。よって、脂質の速報拡散は、0.5μm・秒なので、十分に樹状突起を移動することができるということ。ラスたんぱく質のシグナルが樹状突起を介して隣のシナプスに移動し、スパインのシナプス可塑性の閾値を下げるということは報告されています。もちろん、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置しているわけですから、脂質シグナルがどのようにラスたんぱく質を制御しているかを調べることは興味深いと考えられます。 もう少し、クロストークの背景を教えてください。 NOやエンカンナビノイドなどについても含めて。 NOやエンカンナビノイドのクロストークは、NOやエンカンナビノイドが膜を超えることができて、これがシナプス前膜に作用して、隣接するシナプスへ影響を与えるというものであります。しかし、これらの研究は、専ら、電気生理学で行われており、本当に、隣接するスパインでのクロストークを見ているかについては全く、わかっておりません。 このように、シナプス前膜に作用するわけですが、シナプスのクロストークは何も前膜だけでなくて、シナプス後膜スパインで起きていてもよいわけです。近年、2008年にすぼぼだ博士が始めてRasシグナルが関与しているということを示しました。興味深いことにラスと脂質シグナルは結びついている。よって、脂質シグナルも何か関係があるのではないかと期待しております。 一つのスパインを調べることそんなに必要なの? 大事です。そもそも脳を研究する究極の目的は、脳を完全に理解することです。理解することができれば、それをターゲットとした薬も作ることができる。しかし、現在、記憶を担う記憶の回路については、ほとんどブラックボックスなのです。いきなり難しいことはできない。記憶の最小単位のシナプスがどのような回路パターンで振舞っているのかを調べることができれば、次の高次構造を調べることができる。さらに、神経細胞レベルで調べることができれば、もっと、神経同士のクロストークを調べることができます。だから、スパインでのいろいろな角度からの情報がほしいのです。だから調べることは意義があります。 クラスター化することってそんなに大事なの? これから調べるのでなんとも言えませんが、大事だと考えられます。 これは、ちょっと、大胆な仮説でありますが、例えばりんごという情報を記憶したとする。その時、周りのスパインにも影響を及ぼします。これによって、りんごに付随する情報、赤い、おいしいなどのものを近傍に入力しやすくします。すると、今度思い出すとき、神経回路にとって効率よく思い出すことができる。そのようなことを念頭に考えております。 このためには、例えば、これに脂質シグナルが関与するかを調べるためには、脂質シグナルを樹状突起上で阻害するような、マウスを作ってやって行動解析を行うことによって何か情報が得られるのではないか?もし、この実験でうまくいけば、そのようなことも可能だと考えられます。 カレルのパクリじゃないの? Rasシグナリングは、10マイクロメートル。ねいちゃーのやつも10マイクロメートル。 病気と脂質シグナルの関係は? 最近、報告された例は、2008年にアルツハイマー病に関与するAbたんぱく質を皮質一時神経細胞に加えるとPIP2の量を減らすことが報告された。これは、カルシウム依存的で、しなぷとじゃにんを発現していないラットでは、PIP2の起きないことがわかっている。よって、Abの影響は、しなぷとじゃにんを介してPIP2を減らすことで神経細胞の不全を起こしているのではないか?と考えています。ダウンシンドロームのモデルマウスでPIP2の量が減っているということも知られております。また、加齢マウスでは、PIP2の量が減っていることが知られて、PIP2の原料となる脂肪酸を加えるとPIP2が増えてさらにシナプス可塑性があがることが知られています。また、PIP3シグナルの下流のGSKたんぱく質が、加齢における記憶の再固定に関わっていることが、ノックアウトマウスを使った実験から明らかになっている。 FLIMに最低限必要なこととは? 1.80MHzのパルスレーザー 2.高感度の光電子増倍管 3.ナノ秒オーダーで蛍光寿命を取得するハードウェア 蛍光寿命についてもう少し詳しく教えてください。 蛍光体が励起光を受けると励起状態になります。ここでの滞在時間が蛍光寿命です。励起光が基の準位に戻るときには、3つの過程でもどります。発光遷移(光)、無放射遷移(熱)、蛍光共鳴エネルギー移動です。ここにあくせぷたーがあると、S1状態での蛍光体の滞在時間が短くなる。よって、蛍光寿命を表す減衰曲線が短くなります。 やることたくさんあるけれど、現実可能なのか? やるべきことの重要なポイントとしては。 1.2光子顕微鏡のセットアップ。およびグルタミン酸アンケイジングシステム。これは、MIT時代に習いましたので、単純に組み立てるだけです。 2.FLIMのセットアップ。これも、脂質プローブではありませんが、すでに、FLIMを取るためのノウハウはありますので、あとは、組み立てるだけです。 3.プローブ作りおよびその改良は、1年目で行えます。 4.一度、このようにFLIMが取れる設備が完了すれば、後は、とるだけですのでどのように研究を進めるかというアイディア勝負になると思います。ですので、多くは見えますが、1年あればセットアップはできます。 俺は、こうじゃなくてもいいんじゃない?という質問に弱い。 あと、今まで、考えたことがないようなことを聞かれると弱い。 だけど、これに関しては誰でも一緒。 次に、脂質の移動を止めるために、セプチンたんぱく質を強制発現します。発現します。このたんぱく質は、図のようにスパインネックに発現します。緑がGFPセプチン、赤は神経細胞の形状のマーカーです。セプチンは3nmほどのたんぱく質でこれらがオリゴマーを形成し、スパイン脂質の移動を阻害します。この状態で、一つのシナプスを刺激します。すると脂質の移動は阻害されますから、隣接するスパインの大きさの変わり方は、遠くのシナプスと変わらないのではないかと推測できます。 この実験によって、脂質シグナルがシナプスのクロストークに必要であるかを検証します。 ジーンがんの効率 これは、ばいおらっどとも話したのですが、まず、金粒子が入る確率および発現効率とも調べてないからわかっていないようです。そして、金が入ることによって、死んでしまう細胞も中にはあるかもしれないです。うまい具合に入ったものだけが光る。選択性は多少あります。しかし、この理由はわかりません。入った細胞だけが変なんじゃないの?その可能性は100%否定できるわけではありません。しかし、2つあって、一つは、われわれの用いているシナプス構造可塑性に関しては、問題がないこと。また、他の研究者もこれ以外に遺伝子を導入する方法はなく、これを使っていること。入った細胞だけ大きさが変わっているんじゃないの?実はというと、電顕でアンケイジングしたスパインを見たものがあります。やはり変わっていました。 それって、MITでやったことでしょ?そういうの出しちゃだめだよ。 2光子顕微鏡のメリットは?共焦点との違いは? 励起光が違う。 中まで到達することができる。紫外光による細胞ダメージはない。 ただ、スライスの表面などでは、共焦点でも細胞体は見ることが可能である。 ただ、ゆくゆくはねずみの頭などで行うには、共焦点では明らかに見えません。この理由は赤外光だから 2光子顕微鏡の分解能は、共焦点と同じくらいで200-300 nmくらい? しかし、z軸分解能はとても悪くなる。 また、実際には、うちのシステムは、共焦点ではできません。というのは、あんけいじんぐは、光分解を一点で行う必要があります。共焦点では、できない。 脂質とプローブの関係はどうなっているのか? 普通培養細胞は、1plくらいだと考えられています。 スパインの中は0.1flから0.01flくらい 大体、100倍くらいだと考えられます。 大体、DAGは、1fモルです。一細胞に。 だから、10あぷとモルくらいある。 PIP3の場合は、その100倍くらい少ないから。100ゼプト盛るくらいあります。これが、刺激によって10倍くらいに変わるといわれています。 脂質プローブと脂質の結合能は、かなり高いですから、始めから結合していると考えられます。ここで、刺激が加わると、破壊分析の結果などを参考にしますと10倍から最大で50倍くらいの脂質ができます。これに、プローブが反応して応答するということになります。これは、プローブ全部を応答させるための量く らいできます。 FLIMについてもう少し教えて? FLIMのメリットは?他にないの? 蛍光強度比フレットだと、YFPのスペクトルが漏れて、YFPも励起してしまう。あと、YFPの蛍光のCFPへの漏れこみも問題になってくる。 しかし、FLIMでは、YFPが消えているので問題ない。 現在は、場所をきちんと記憶できるようなステージがあるので、これを用いてシナプスの場所を特定して、アンケイジングを行って免疫染色を行うというのは不可能なのか? 答え。ポイントは、リアルタイムでとることができないということになるでしょう。2番目には、刺激前と後で比較を行うことができないということです。 あなたのプローブ本当にそのように働いているの? 例えば、グリシングリシンを除くとうまく働かなくなる。また、脂質局在ドメインを除いた細胞質プローブではうまくいかないなどの点から、確かに、このプローブのポイントとなるところがきちんと働いて脂質を検出していると考えられます。 現在、FLIMを行っている人の研究者はどれくらいいるの? 神経細胞ということで、FLIMの論文を出しているというところになると、3人ほど思い出します。一人目はハーバードのMGHで、アルツハイマー病のマウスやラットにおいて、カルシウムシグナルがどのように変化しているかを調べているぶらいあんばくすかい博士。しかし、この研究はシナプスではなく主に細胞体で調べております。次に、スパインレベルであると、かなり少なくて、かれるすぽぽだと、やすだりょうへい博士です。やすだ博士はかれるのぽすどくでした。近年、MIT時に林研で作製したCaMkIIプローブをFLIMに改良してCaMkIIの活性を調べて高い評価を受けたことは記憶に新しいです。 脂質の動態ということになると、培養細胞レベルでは、京都の松田先生が、私たちのプローブを用いて脂質の動態を観察しております。斉藤尚明先生がPKCの活性化を調べております。 Roバリューはどれくらい。50から60Åくらい。 2光子と共焦点の違い 実際、共焦点でもスライスくらいだったら神経細胞体のカルシウムイメージングなどは可能である。 今まで、細胞質タイプのプローブで見られていると思うけれどあれじゃだめなの? はい、まず大前提にあるのは、細胞質タイプのプローブで調べられているのは、神経細胞全体を刺激しているということ。そうすると、全体が刺激されるので、プローブの局在をみることができます。しかしながら、一点でグルタミン酸刺激を行うと、細胞質タイプでは見ることができません。何故かと言うとポイントは、バックグラウンドです。 どのくらいの長さイメージングするの?シナプス構造可塑性の実験では、大体一時間くらい。ですので、一時間くらい観察しようと考えております。 プローブの局在はどうなるの?私のプローブ分子には、N-rasの脂質修飾ドメインがついております。スパインおよび樹状突起です。 メカニズムは?ファルネシル基で小胞体に結合し、パルミトイル基で細胞膜に結合します。 昔の研究のぽいんとは? 私のプローブ分子の特徴は、2点あります。 それによって、図で示す。 透明YFPの原理? 蛍光は、蛍光体が高い順位から低い順位に移るときに起きます。 その際に、発光遷移のほかに、2つ影響を受けるものがあります。 一つは、無放射遷移、これは、熱によるもの。 2つめは、蛍光共鳴エネルギー移動。 透明なYFPの場合は、この無放射遷移で起きています。 この研究で困難だと思われるところはどこでしょうか? カルシウムシグナリングとの関係は? カルシウムによって、CaMKIIなどが活性化しシナプス可塑性を誘導します。阻害剤を加えた実験から、カルシウムシグナリングも脂質シグナルもどちらも、シナプス可塑性に重要であることがわかっています。しかしながら、カルシウムシグナリングは、スパインで留まることが知られています。よって、シナプスのクロストークはむしろ代謝型グルタミン酸受容体が関与しているのではないかと考えております。しかしながら、グルタミン酸受容体の下流の脂質シグナルは、カルシウムシグナリングに比べてほとんどわかっておりません。よって、調べるために意義のあることだと考えます。 岡本さんのFRETの図と安田さんの図 これすべて、すでにできているんじゃない? 簡単にできるんじゃないの? 確かに、2光子顕微鏡のセットアップ、アンケイジングシステムのセットアップ、FLIMの測定のノウハウは知っていますが、実際組み立てるのはかなり時間がかかります。あっという間に1年かかります。逆に言うとそれくらいじゃないと3年間では終わりません。 他に、どんなFRETプローブを作ったら面白いの? FLIMは本当に高感度か? シナプス可塑性ってどうやって測るの? MIT時代には何をやってきたのですか? 大きく分けて3つあります。2行使顕微鏡のセットアップのノウハウ。アンケイジング法のノウハウ。FLIMの測定のノウハウ。実際、私、昔脂質の研究を行っていまして、脳という新しい分野に挑戦するに当たって、脳のことほとんど知らなかったので、しかも、初めての海外ということで言葉は通じないし、林先生に朝から晩まで働かされるし、本当に大変でした。 FLIMとかだしちゃっておかしくない?書いてないよ? 2点ありまして、1点目は、申請書に書ききれなかったということ。 2点目は、私は、常に面白いアイディアを考えております。よって、面白いものがあれば、どんどんアップデートをしていきます。 何か、脂質シグナルがシナプスのクロストークに関係しているという証拠はあるの? 確定的な証拠はありません。間接的な証拠としましては、PIP3シグナリングは、1時間以上も続いているということ。これは、高頻度の電気刺激をおこなっってシナプス可塑性を誘導したときに、PIP3産生酵素PI3Kの阻害剤であるLY29を加えたときに、シナプス可塑性が阻害されるということからわかります。よって、脂質の速報拡散は、0.5μm・秒なので、十分に樹状突起を移動することができるということ。ラスたんぱく質のシグナルが樹状突起を介して隣のシナプスに移動し、スパインのシナプス可塑性の閾値を下げるということは報告されています。もちろん、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置しているわけですから、脂質シグナルがどのようにラスたんぱく質を制御しているかを調べることは興味深いと考えられます。 では、他に何か面白いテーマはないの? 確かに、PIP2は、シナプス前膜で調べられているので、ベシクル小胞が放出する際に、このプローブをシナプス前膜に導入しておいてどのような時に産生しているのかということを調べることは重要です。それよりも、私が興味を持っているところは、シナプス構造可塑性、つまり、シナプスが大きくなるときに、劇的に脂質の量が増えているわけです。短期間でのこの脂質の増加は、ちょっと信じられません。例えば、細胞分裂は5時間ほどをかけて1つが2つになるわけですが、この可塑性に関しては、1分以内に2倍以上になるわけです。この時、とんでもなく脂質代謝が動いていると想像できます。そのパスは2つあって、1つは、細胞膜で激しく脂質産生酵素が動いていること。もう一つは、トランスゴルジなどから激しく膜輸送が起きること。どちらかを調べることはとても面白いと考えております。 私は、常に、よくなるように考えております。ですので実験がよいと思えば変えます。本筋は外れておりません。 従来までのグルタミン酸を放出する方法。 バスアプリケーション。マイクロパフ。電気刺激 刺激はどのようにやっているの? 0.5Hz.2ms、1Hzなど。とにかく電気生理でシナプス可塑性が起きていれば大丈夫。 クロストークをとめたら連想がとまった。 脂質シグナルをとめたら連想することができなくなった。 How much does enlargement of spine happen? How much does lipid second messenger is there? Is it right to tell lipid signaling as controller of signal? What is the function of septin? Septin is discovered in1971 in budding yeast mutants defective in cell-cycle progression. If you overexpress the septin, not only lipids but also the protein, which localize in membrane, is stopped by the septin, right? I need to prepare the septin, which have mutant ATP binding site or mutant enzyme activity delation mutant. You should learn the mechanism the pathway until producing lipid second messenger. ラフトによって、もっと上流のたんぱく質は動くことがないのではないか? Gたんぱく質はそるブルだから大丈夫。しかし、Gbrは膜局在型。代謝型グルタミン酸受容体はどのGたんぱく質を活性化するのか?また、PLCデルタ、PLCβは泳ぐが大丈夫か? ラフトとPIP3の関係は? 確かに、ラフトみたいなところでできますが、物理的な面から言うと、ラフトは、比較的飽和脂肪酸を足に持った脂質がいるところです。PIP3,DAGの足は、ステロイルアラキドノイルなので、ラフトをでることはあながちおかしくないと考えられます。 脂質の組成がミックスしないようにたんぱく質がバリアを作っているということは結構ある。らてらるとばそらてらる。 でんどらいとにのみ発現しているようなたんぱく質はないだろうか? What size is lipid? ゴーシュ型でC-C 1.513; C-H 1.112 Å アンチ型でC-C 1.511C-H 1.112 Å 大体DAGは5Å, 10Å PIP3は10Å, 10Å PTEN, DGKをノックアウトしたらどのくらいまで伸びるのか? 本当に脂質はシグナルの司令塔なの? 西塚先生を出す。 デイビッドホロビンを出す。 脂質って細胞膜からどれくらい出ているのか?PIP3だったら15nm以上は出ていると思う。 もし、始めから脂質の移動が阻害されていたらどうする? 確かに、CaMkIIはスパインでのみ活性化されることが知られている。 しかし、Rasは結構長く伸びることが知られている。 脂質の移動を阻害するものの有力なものとして、セプチンがあげられるのですが、エンドジーニアスなセプチンもあります。ただ、結構、すべてのスパインネックに存在しているわけではなく、もしかしたら、脂質の移動を変えるような働きをしている可能性があります。クロストークに選択性があるということでとても面白いということになります。 脂質シグナルをスパインで見ることの重要性。 2光子顕微鏡のメリットとは? 共焦点でも、スライスでも見えるんじゃないの? 別に、2光子顕微鏡で見なくてもいいんじゃないの? 何故あなたは脂質シグナリングを選んだのか? 1.脂質シグナルは移動することができるシグナルの最上流である。 2.脂質シグナルの特にPIP3シグナリングはしばらくの間持続する。 PKCの局在を見てみるとデンドライトでも起きている。やっぱり脂質は移動していると考えられる。 実は、かれるによって、らすシグナルが閾値の上昇に必要だということがわかっている。しかしながら、何故ラスなのか?実は、ラスはPIP3の下流なんですよね。 PTENの局在。 DGKの局在。DGKはカルシウムによって活性化されるが、神経細胞でのカルシウムの上昇は瞬時である。 これによって、あるシグナルに反応しやすくなるようになり、ある反応に応答するシナプスクラスターができるのではないだろうか。 シナプスのクロストークに脂質シグナリングが関係していなかったら? 脂質修飾のメカニズムについて。 PIP2の局在は?下の論文にあるように恐らく均一に存在する。 しかし、結局のところ活性化されたグルタミン酸受容体がどこにあるかが重要でさらに、活性化したPI3KとPLCがどこにあるかによる。 Neuroscience Letters 423 (2007) 158–161 もしかするとPLCやPI3Kがデンドライトまで泳いでいって、PIP2を代謝することはないのか? 恐らくないと思う。その根拠は、代謝型グルタミン酸によって活性化されるPI3Kはp110rだと考えられます。 このたんぱく質は、脂質修飾を受けているたんぱく質とコンプレックスを作っている。 もしかしたら他の脂質修飾されていないようなたんぱく質がPIP3を作る可能性があるかもしれないよ。 そしたら、それは、わかりません。ただ、ここで重要なのは、PIP3ができて、それが樹状突起を移っていくことが観察できればいいのだと考えております。 PI3kは1,2,3型が存在する。そのうちPIP2を基質とするものは、I型だけである。一般的なI型のA型は、チロシンリン酸型受容体によって、活性化される。一方、I型のB型は、p110γであり、これは、Gたんぱく質共役型受容体によって活性化される。Brとアダプターたんぱく質のp101と複合体を形成する。このため、かなり移動度が遅いと考えられる。よって、PIP3のような低分子の方がかなり早く動けるのではないかと考えております。 よって、PIP3の量は、PTENとPI3Kのバランスで決まっている。しかし、 PIP3を作り出す刺激は、グルタミン酸受容体だけなの? いえ、恐らく他にもあるとかんがえられます。しかしながら、今回絞っているのはグルタミン酸受容体だけです。 DGKはどこにいるの?細胞質中にいますが、DGKは、9つのアイソフォームがあって、α、βは、PSD結合ドメインを持っていないが、γ、ζはもっている。基本的に、デンドライトシナプスにいるが、後者は、PSDに濃縮されている可能性もある。 別にあなたのプローブじゃなくてもサイトゾルプローブで赤と緑比較してできるんじゃないの? 実は、それでは難しいです。というのは、仮に、フレットプローブと膜局在プローブが培養細胞などで100%応答した場合どちらも、最高の状態となります。しかし、神経細胞においては、デンドライトと繋がっていますから、さらに、プローブが入ってしまうわけです。すると、膜局在方はこの赤と緑がバックグランドとなって、感度が小さくなってしまうということがあげられます。よって、FRETプローブの方が応答はよいであろうと考えら得ます。 mGluRによって活性化されるPI3Kとして、IB型が挙げられる。これは、Gbrによって活性化される。 ちなみに、NMDA依存的にPIP2が減少する系も存在する。これには、2つの可能性が挙げられる。PLCが泳いでいった。もしくは、樹上突起にも受容体が多少なりとも存在し、それが活性化した。しかし、今調べたいのは、スパインから産生された脂質分子であるから系が全く違うと考えられる。 PIP3は、様々な方法で産生されると考えられる。スパインにはチロシンキナーゼ受容体EPH受容体なども存在するだろう。だから、PIP3が産生されるメカニズムはたくさんあると考えられる。しかしながら、今回はグルタミン酸受容体を考えているからそれによって活性化されるのは、代謝型グルタミン酸受容体だと考えられる。 もしかすると、brが移動するかもしれない。しかしながら、脂質とGたんぱく質どっちが移動が早いかというと、grの方が大きいから移動しづらいと考えられる。 Rasの活性化は、11microm//4 minである。とても遅い。結局、上流のシグナルがどうなっているかについての情報は何も与えないことになる。 クロストークを行うと何がいいのか? スパインネックが見えないんだけれどどういうこと?本当にくっついているの? 何分後に刺激をするの? どんな点が困難だと考えられるのか? 逆に、スパインで制限されたらどうするの? 答。もちろん計画を立てるときには一番面白い作業仮説をたてるわけであります。それはそれで面白いと考えられる。その一つとしてセプチンが上げられます。 普段から脂質はセプチンによって抑えられているんじゃないの? セプチンは、細胞質のたんぱく質の拡散も防ぐんじゃないの? それは、GFPを発現させてホトブリーチすればよい。 それを調べるためには、セプチンRFPを発現させて本当にセプチンが阻害するかを調べればよい。 スパインの大きさってどれくらい? シナプスのクロストークにプラスマイナスはあるのか? タイトルはゴシックにする。 申請者の利点はちょっと変えるべき。 何故FRETを使うか?理由を述べる、 脂質シグナルをわからせる 10出たものが拡散してしまうと3になってしまう。それでよいのか? セプチンの情報 あるセプチンは、PIP2などとくっついて膜のbracingを起こす。Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Tanaka-Takiguchi Y, Kinoshita M, Takiguchi K. Curr Biol. 2009 Jan 27;19(2) 140-5. DiIは分裂溝を通る。 ただ、Dilは細胞膜の表面に入ることから表側である可能性が高い。 細胞膜の成分をミックスしないで、そのまま分けるという役割を持っているたんぱく質の一つにセプチンというたんぱく質があります。セプチンは、主に細胞分裂の際に分裂溝にセプチンリングを形成し、細胞分裂に必要なたんぱく質です。また、細胞膜上の成分をミックスしないようにしているからです。 ですので、 スパインのコンパートメントについて カルシウムは、シナプスで制限される。 CaMKIIも同様に制限される。 しかしながら、Rasたんぱく質は制限されずに、クロストークに必要である、ただ、ラスたんぱく質は、カルシウムシグナリングによって活性化される。LY PTENの局在について 基本的に、PTEN is preferentially expressed in neurons and is especially evident in Purkinje neurons, olfactory mitral neurons, and large pyramidal neurons. To analyze the function of PTEN in neuronal differentiation シングルセルでは、核と細胞質中に存在することがわかっている。 一人目の先生が、免疫染色でPIP3の進展は確認されているの?という質問をしてきた。俺は、前に佐々木とそのことについて話していたにも関わらず、うまく説明することができなかった。結局、リアルタイムで取れることが大事だという風に言ってしまったが、そうじゃない。本当の答えは、シナプス構造可塑性を起こしたスパインを、一度視野からはずして、免疫染色して見るというのは極めて不可能に近いということである。そのように答えないと正解とはいえない。今考えてみると、ちょっと、彼も不思議そうな顔をしていた。
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脊椎動物の神経系において神経作用の支配的な中心をなしている部位をいい,無脊椎動物では頭部背側にある食道上神経節を脳または頭神経節という。脊椎動物では,脳(頭蓋腔のなかにある)は脊髄(脊柱管のなかにある)とともに中枢神経系を形造っているので,脳は中枢神経系の部分であるわけであるが,〈脳〉という言葉は,中枢神経系を代表するものとして〈中枢神経系〉の意味で用いられることもある。 脊椎動物の中枢神経系(脳と脊髄)には,末梢神経系(脳神経と脊髄神経)を通じて外界や自分自身の体に関する情報が送り込まれる。中枢神経系はこれらの情報を処理し,一定の指令を末梢神経系を通じて効果器(筋肉や腺)に送り出して,外部環境に合目的的に適応するとともに,内部環境を恒常的に維持する機構に参加している。このように,中枢神経系は情報を送り込んでくる入力ニューロン(感覚神経節のニューロン)と,指令を直接末梢に送り出す出力ニューロン(運動ニューロンや自律神経の起始ニューロン)との間に介在するニューロンの集合とみることができる。入力ニューロンが出力ニューロンに直接連絡している場合は,反応の速度の点では有利であるが,情報に応じて反応を細かく調節することはできない。入力ニューロンと出力ニューロンの間に介在するニューロンの数が増すほど,入力ニューロンからの情報に対する出力ニューロンの応答をいっそう精妙に調節できるはずである。すなわち,中枢神経系が発達するほど,一定の入力情報に対する生体の反応に選択性が増す。神経系を〈不確定性の貯蔵所〉とみる H. ベルグソンの考え方(《創造的進化》)はこの意味で正しいといえるであろう。 【ヒトの脳】 [脳の発生と区分] [ニューロンのネットワークの形成] [神経核――中枢神経系におけるニューロンの集合] [神経路または伝導路] [脳の重さ(脳重)について] [脳の血液循環] [脳の物質構成とエネルギー代謝] [脳の活性物質] [血液脳関門] [脳の可塑性 [脳の階層構造] [大脳の機能局在] [大脳の連合野機能] [左右脳の機能差] [脳と心の問題] 【動物の脳】 *