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Happy Dance Day 2 U(激) 曲名 アーティスト フォルダ 難易度 BPM NOTES/FA(SA) その他 Happy Dance Day 2 U Shoichiro Hirata feat.ちょぴん WORLD 激14 137 447 / 21 楽譜面(7) / 踊譜面(11) / 激譜面(14) 属性 譜面 https //livedoor.blogimg.jp/yanmar195/imgs/0/3/039e7282.png 譜面動画 https //www.youtube.com/watch?v=1slZN3jY8fA (x3.25, NOTE) 解説 2024/7/4追加。無条件解禁。 「DanceDanceRevolution 25th Anniversary ～ボーカルオーディション～」合格者による楽曲。 名前 コメント コメント(私的なことや感想はこちら) 名前 コメント
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Merry2 Xmas for you, Happy2 birthday to you, Today is your white Xmas, yeah! Very2 thanks for this day. 今日は特別な日 みんなにとっての素敵な日 この聖なる日に 運命がドアを叩くよ Shalala2 今日は君が Shalala2 生まれた日さ そうさ 今日は 君と僕が Shalala2 出会った日さ 名前 コメント
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【登録タグ CD CDH YSCD 全国配信 市ノ瀬雪乃CD】 前作 本作 次作 Tired of the World HAPPY COLOR GUMMY 妖精族のむすめ YS 柏木るざりん 発売：2012年6月26日 価格：￥1,500 / 1曲￥150 流通：配信 レーベル：KARENT ジャケットイラスト：市ノ瀬雪乃 iTunes Storeで購入する CD紹介 YSこと、ゲームミュージックの作曲者下田祐氏の配信アルバム。 YSプロデュースによる、VOCALOID「メグッポイド」の歌をメインに、UKインディーロックとプログレッシヴロック、8ビットゲーム機のピコピコサウンドといった要素がポップに混ざったアルバム、第二段です。 Tr.6は柏木るざりん氏との共作。 KARENTレーベルの、メグッポイド発売3周年記念企画で配信された作品の1つ。 曲目 KEY （feat. メグッポイド） HAPPY COLOR GUMMY （feat. メグッポイド） さくらブロッサム （feat. メグッポイド 初音ミク 鏡音リン） 何もかもが嫌になった2012 （feat. メグッポイド） 優しい世界2012 （feat. メグッポイド） GMLのテーマ （feat. メグッポイド 初音ミク） 千日前のインド人を右に （feat. メグッポイド） お母さんが好きな韓流 （feat. メグッポイド） 愛の証明 （feat. メグッポイド） 夢追い人 （feat. メグッポイド） 雪国Snowblind （feat. メグッポイド 初音ミク） これは無理だ （feat. メグッポイド） 明るい未来を！ハイホー！ （feat. メグッポイド） リンク 作者サイト KARENT：「HAPPY COLOR GUMMY」 KARENT：「メグッポイド3周年記念祭」特集ページ コメント 名前 コメント
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HAPPY BIRTHDAY 三ノ輪銀 背景解放前 背景解放後 CV 花守 ゆみり ステータス ※ステータスの数値は初期値になります。 型 属性 レア度 HP ATK 踏ん張り 速度 CRT コスト SP 近接型 黄 SR 1630 2440 C+ B E+ 24 26 リーダースキル 暴れん坊 黄属性の勇者の攻撃ペース+10% 必殺技 翔天斧・壱式 種別 効果 ゲージ 技再使用時間 攻撃ペース昇 クリティカル減 10倍ダメージを小円範囲の敵に与え、15秒間自ペアの攻撃ペース+20%、CRT150減少 2 20秒 アビリティ いってらっしゃいアナタ 発動条件 効果 撃破 敵撃破時、6秒間自ペアの攻撃ペース+10%、ATK10%減少 神花・覚醒 神花/覚醒時 獲得精霊 初回神花 二回目回神花 三回目神花 R鈴鹿御前(黄) SR鈴鹿御前(黄) 一定覚醒値報酬 必要覚醒値 7 【背景絵】 SR鈴鹿御前(黄)×5 神花解放 段階 必要コイン 必要属性結晶 上限Lv30 6,000 黄の欠片x5 上限Lv50 - - 上限Lv70 - - ボイス 1 - 2 - 入手方法 イベント「11月 HAPPY BIRTHDAY 友の夢を 後編」ステージスコア全獲得報酬、バトルドロップ報酬 名前
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第００２号 今週の脳のお話について 人をはじめとする生き物は、常に何かを覚えて、そして何かを忘れて生きています。 脳の中で何かが変わっているから覚えられるわけですよね。 それでは、何が変わっているのでしょうか？ この謎について、どこまでわかっているのか？そしてまだわかっていないことは何なのか？このテーマを中心に脳の様々な働きを知っていきましょう。 私たちは、意識することはなしに日々生活していくなかで、脳をたくさん使っています。例えば一日の行動を例にとってみます。 朝起きた時は、眠りから覚めるわけですよね。いわゆる、眠った状態の意識のない状態から、意識のある状態に変わるわけです。つまり「意識」という脳の働きをオンにします。 後に洗面所に行き、顔を洗います。 うわっ、水が冷たいけれど気持ちが良いな！と感じたら、 この時、脳は、顔の表面で冷たいけれど気持ちがよいという情報を「知覚」します。 朝ごはんを食べながら、昨日の晩御飯のフランス料理のワインはとってもおいしかったな。 また行きたいな。など、「記憶」をよみがえらせます。 と例を挙げたらきりがありませんが、このように私たちは脳の働きをフル活用することによって、日々の生活を送っているのです。 このように様々な働きを持っている脳ですが、 脳はどのような方法で、働いているのでしょうか？ ちょっと考えてみてください。調べるといっても生きている人間の脳を切り開いて調べることはできないですよね。もちろん、亡くなった方の脳を切開して脳の形やおかしくなってしまったところを調べることはできるのですが、上にかいたような意識、記憶、知覚などは、調べられませんよね。だから、もともと脳のある部分に損傷があることが分かっている人たちを調べることによって脳科学は進歩してきました。 実は、脳研究が進んだのは１９世紀初頭の世界大戦の時だといわれております。 爆発によって脳の一部が傷ついてしまった人、銃弾が頭の中に入ってしまった人などたくさんいたのですが、その中に、ある部分が傷ついてしまったために、しゃべれなくなってしまったり、ほかの部分が傷つくことによって目が見えなくなったりなどの患者さんがでてきました。この結果を集めてみると、どうやら見る、話すなどの人間の機能は、脳のそれぞれの領域が担っていることが明らかとなってきました。ペンフィールドの脳地図というものがあります。 http //www35.atwiki.jp/happyhappyhappyhappy/pages/45.html このように、話す、聞くなどの基本的な役割は、脳のそれぞれの部分が担当しているということがわかったのです。 例えば、言葉を司る部位は、脳の左側にあることがわかっています。 皆さんも、左脳は理論的な思考を司り、右脳は芸術的な感覚を司る、右脳説左脳説を聞いたことがあると思います。だから、芸術家に育てるためには、右脳を鍛えなければいけないというような話です。 ただ注意しなければいけないのは、言語は、記憶を基にして話されることもありますし、人の表情を見ながらその雰囲気や環境にも影響されるはずで、脳のその他の部位と互いに連絡を取り合いながら処理されるわけです。時には右脳との連絡も必要でしょうから、単純な話ではなさそうです。 話の説得力のある人などがいますが、彼らは単純に言語能力にたけているだけでなく、聴衆の表情を見て話を進めていくなどの能力もたけていると思います。なので、話すことに注意をむけるだけではなく、視覚や聴覚から入ってくる情報に気をつけることが重要ではないと考えております。 来週の予定 来週は、脳のどの部分がどの能力に関わっているのかを、実際の症例をしめして説明していきたいと考えております。
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25/Nov/2011 probeの解離定数を求める。 I am gonna determine Kd value. 2 units/ml Bc-PLC 2/5 units/ml Bc-PLC 2/5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5*5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5*5*5*5 units/ml Bc-PLC 2/5*5*5*5*5*5*5 units/ml Bc-PLC 0 units/ml Bc-PLC At the same time, I am gonna determine real amount of DAG level by brigh and dyer method. 18/Nov/2011 SMの量におけるD609の影響をMDCK細胞で調べる。 Effect of D609 on SM level in MDCK cells 1)ctrl 2)SMase 3)3hour D609 incubation 4)6hour D609 incubation 5)20hour D609 incubation mCherry-lysenin conc is 50microg/ml. 1 30 3hour 4 30 6hour 6 00 20hour SMase 1 units/ml 10 min. After that, fixed. What I have to prepare is that HBSS and 3 % PFA Effect of DGAT inhibitor on DAG level in MDCK cells. 1microM A922500 was used for this experiment. 2pm Add A922500 start incubation 4pm Add A922500 start incubation 5pm DAG probe incubation. こんなかんじで 17/Nov/2011 Rat red blood cell experiment, At first, I did the experiment as follows 1)1U/ml Pc-PLC + 200times annexin V + 9*108 cell/ml result hemolysis within 4 min 2)0.1U/ml Pc-PLC + 40 times annexin V + 9*108 cell/ml result hemolysis within 5 min In this time, protocol was wrong. 3)real experiment 0.1U/ml Pc-PLC + 40 times annexin V + 9*108 cell/ml I get annexin V fluorescence but it is not for living RBL cells. At first, RBC was subjected to hemolysis, become ghost, and then become fluorescence. 4)0.1U/ml Bc-PLC + 40 times annexin V + 9*108 cell/ml RBC rarely give hemolysis and no fluorescence. And I tryed the experiment whether Bc-PLC makes DAG on the plasma membrane in RBC in a Bc-PLC conc. dependent manner. 1) 800 microl RBC (9*108 cell/ml) 2) Add DAG probe 24 microl here And 3)2microl 100 units/ml Bc-PLC was added to the 8 microl HBSS. 4)2microl of this solution was added to next tube, which has 8 microl HBSS. 5)this step is done one after another. this means that 5 time solution is gonna prepare. Next in each tube, 75 microl RBC solution was added and is incubated for 10 min @r.t. after that, fixed 6% (final 3%), and incubated for 15min. and spin down. こんな感じでやりましたよーん。 30/Oct/2011 D609の濃度 50microg/ml Offered as 5 mg (sc-201403) and 25 mg (sc-201403A) sizes Synonym O-Tricyclo[5.2.1.02,6]dec-9-yl dithiocarbonate potassium salt CAS Number 83373-60-8 Molecular Weight 266.5 Molecular Formula C11H15OS2K Purity 98% Physical Appearance Off-white solid Solubility Soluble in water (25 mg/ml) I used D609 with the concentration of 188microM 以下のものをやってみる。 Other experiments 1. living MDCK cells with alpha PMA and PMA 2. DAG probe calibration with Bc-PLC Bc-PLC 20 units/ml Bc-PLC 10 units/ml Bc-PLC 5units/ml Bc-PLC 0units/ml D609 3. fixed MDCK cells with SMase noSMase SMase SMase+D609 SMase+BcPLC 4. living MDCK cells with SMase + Bc-PLC 5. SM amount with SMase or nojirimycin 6. DAG amount with SMase or nojirimycin 111016 もう一度最後の実験 以下の実験を２回繰り返す。 それぞれについて１０個の細胞をとる。 それでanalyzeして終わり。 Thinking about biological significance, I am gonna try this experiment as follows. 1. noSMase 2. SMase 3. SMase+D609 4. SMase+BcPLC 16/June/2011 Now I started to write the papers. But I have several experiments I have to do and I want to do. 1. test if the DAG which exist already on the membrane is abolished by incubated with D609. 2. I am gonna take beautiful data of cholesterol, DMS and NB-DNJ. SMS2がPC-PLCであるか否か？とういうことに関係するのですが、 D609処理した細胞で、ライセニンで染まるかどうかという実験を過去にラボでやった人はいらっしゃいますか？ あと、SMS1およびSMS2が欠損したMEF-ZS2とSMS1もしくは、SMS2が発現させた細胞では、ライセニンで染めるとどのように違いがでますか？ こちらについては、やっているのではないかと思い聴いて見ました。 And then I want to get the PC-PLC antibody. 20May2011 I am gonna do the experiment. I don t miss to write but in the previous experiment. UV was irradiated to MDCK cells for 1 min. 30 min, 1hour 2hout later, the cells were fixed and observed. 30min there is 30% cells in which DAG probe was translocated. But not so obvious. So I am gonna do 10 min incubation after UVB irradiation. Because some papers says that 10 min is more DAG. So, 1. UVB 10min 2. UVB D609 10 min 3. No UVB And then the previous experiment that when MDCK was fixed, DAG probe localized at the plasma membrane incubated with 12.5 Bc-PLC 10 min. So, I need to play around the concentration of Bc-PLC. 4. Bc-PLC 0 microunit/ml 5. Bc-PLC 0.1 microunit/ml 6. Bc-PLC 0.5 microunit/ml 7. Bc-PLC 1 microunit/ml 8. Bc-PLC 5 microunit/ml 9. Bc-PLC 12.5 microunit/ml And then, U73122 doesn t abolish ATP-induced DAG on the outer leaflet of plasma membrane. So, I suspect PAP-induced DAG. I am gonna use the propranolol. 10. ctrl 11. D609 12. D609+ATP 13. D609+ATP+propranolol At the same time, I am gonna use the MDCK cells expressing mGluR5 and bath application of glutamate. 14. ctrl 15. glutamate 06May2011 I gonna do the experiment about DAG flip in fixed cells. A. EYFP-C1AB and DsRed B. EYFP-C1AB and DsRed with 10mM MbCD + 12.5unit/ml BcPLC C. EYFP-C1AB and DsRed with 20microM Fumonisin B1 + 12.5unit/ml BcPLC D. EYFP-C1AB and DsRed with 50nM ISP1 + 12.5unit/ml BcPLC E. EYFP-C1AB and DsRed with 6 microM DMS + 12.5unit/ml BcPLC F. EYFP-C1AB and DsRed with 100 microM NB-DNJ + 12.5unit/ml BcPLC G. EYFP-C1AB and DsRed with Bc-PLC as ctrl H. EYFP-C1AB and DsRed with PMA 28Apr2011 How to irradiate UVB (290-320nm) 1. reduce the volume of medium, DMEM 100 microl. Go to program 2. Set 10 mJoules/cm2 for 1min 3. replace the medium with appropriate media. That s it. 27Apr2011 Now Francoise kindly decide the condition of UVB irradiation. So I am doing the following experiments under the condition. I will observe DG probe and PKCdelta antibody accumulation. 1. Ctrl(negative) Just MDCK cells. 2. Ctrl(positive) PMA 3. UBV and leave 30 min 4. UBV and leave 1 hour 5. UBV and leave 3 hour 7. UBV and leave 30 min with D609 (D609 nothing after UVB) 8. UBV and leave 1 hour with D609 (D609 nothing after UVB) 9. UBV and leave 3 hour with D609 (D609 nothing after UVB) 10. UBV and leave 3 hour with D609 (D609 still incubation after UVB) 11. no D609 12. D609+100microM ATP 13. D609+100microM ATP+1microM U73122 22Apr2011 Thinking about the experiment I have to do. 1. I can get PKCgamma antibody within next week. So I gonna do the following experiment. A. EYFP-C1AB, PKCgamma antibody, DsRed. B. EYFP-C1AB, PKCgamma antibody, DsRed with SMase. C. EYFP-C1AB, PKCgamma antibody, DsRed with SMase and D609. 2. check whether DAG flop is inhbited in the presence of U73122. Actually when I did this expeirment previously using 100 microM U73122, unexpectedly more bright fluorescence comes up. Maybe some artifact. So I gonna reduce the concentration of U73122. A. 100 microM ATP B. 100 microM ATP, 10 microM U73122 C. 10 microM ATP D. 10 microM ATP, 10 microM U73122 3. I am gonna observe the effect of MbCD, FumonisinB1, ISP1, DMS and NB-DNJ in fixed cells. A. EYFP-C1AB and DsRed B. EYFP-C1AB and DsRed with 10mM MbCD + 12.5unit/ml BcPLC C. EYFP-C1AB and DsRed with 10microM(?)Fumonisin B1 + 12.5unit/ml BcPLC D. EYFP-C1AB and DsRed with 50nM ISP1 + 12.5unit/ml BcPLC E. EYFP-C1AB and DsRed with 6 microM DMS + 12.5unit/ml BcPLC F. EYFP-C1AB and DsRed with 100 microM NB-DNJ + 12.5unit/ml BcPLC 07Apr2011 Thinking about discussion with Francoise. 1. I am giving Francoise MDCK cells. 2. I gonna show the paper I am preparing now. 3. I gonna give her D609, rottelin Reiko has. 4. I gonna give her the paper relationship with D609 and apoptosis, with rottelin and apoptosis, and MDCK and apoptosis, SMase and apoptosis. 25/Mar/2011 Thinking about biological significance, I am gonna try this experiment as follows. 1. noSMase 2. noSMase+U73122 3. noSMase+D609 4. SMase 5. SMase+U73122 6. SMase+D609 7. SMase+BcPLC 8. SMase+BcPLC+U73122 Express EYFP-C1AB, DsRed and PLCepsilon-HA Express EYFP-C1AB, DsRed and PLCepsilon-HA(dominega) Express EYFP-C1AB, DsRed and PLCalpha-HA Express EYFP-C1AB, DsRed and PLCalpha-HA(dominega) 24/Mar/2011 And then, I found another contraversy. In IPS1 experiment, flip doesn t occure even though without SM. I need to do same experiment with SMase. 22/Mar/2011 I am gonna do the following experiments from the data I took on 15/Mar/2011. At first, 10 microM U73122 experiment doesn t work. So I am gonna do increase its concentration or decreases in ATP concentration. This experiment is very critical to say that the EYFP-C1AB fluorescence is caused by DAG drived from PI-PLC. 1. 100 microM ATP 2. 100 microM ATP, 100 microM U73122 3. 100 microM ATP, 100 microM U73343 4. 10 microM ATP 5. 10 microM ATP, 100 microM U73122 6. 10 microM ATP, 100 microM U73343 Another point I have to mention is that 24 hour incubation with U73122 did not give the difference in outer DAG signal compared to ctrl. This means that PI-PLC doesn t contribute to outer DAG. But, I can see PI-PLC dependent outer DAG sigal. So I want to make clear the signal from PI-PLC caused by ATP addition is transient or sustained. I guess this signal is transient. I am gonna do 10min, 30min, 1 hour, 2 hour. In some case I am gonna remove the ATP in the middle of reaction. 15/Mar/2011 I am gonna take reproduciblity. 1. MDCK Cameleon with ATP no D609 2. MDCK Cameleon with ATP with D609 3. MDCK control no D609 4. MDCK D609 only 5. MDCK D609 ATP 6. MDCK D609 ATP U73122 7. MDCK D609 ATP U73343 8. MDCK D609 ATP R59949 9. MDCK D609 ATP SMase 10. MDCK D609 PMA 11. MDCK D609 DiC8 12. MDCK C1AB inner no D609 13. MDCK C1AB inner no D609 ATP 14. MDCK C1AB inner D609 15. MDCK C1AB inner D609 ATP 16. MDCK mGluR no D609 17. MDCK mGluR D609 18. MDCK mGluR D609 Result Patially success. I got good result about that in the presence of D609 and ATP the DAG signal was detected, but no signal in the presence of D609 only. Of course, no D609 gives very bright fluorescence. But disappointed point is that U73112 did not inhibit the fluorescence which is caused by addition of ATP. Interpretation of it is due to week effect of U73122. I need to increase in concentration of U73122 or decrease of concentration of ATP. And then, the points I need to condider is that in the presence of U73122, which is 24 hours incubation, DAG signal did not decreases. But transient increase caused by inner DAG caused by ATP through PI-PLC is detected. How do I come to term with these. 09/Mar/2011 The idea to observe DAG flop. 1. no D609 2. ctrl 3. ATP 10 min 4. ATP U73122 10 min 5. ATP R59949 10 min 6. ATP SMase 10 min 7. PMA 10 min 8. DiC8 10 min 9. Inner C1AB ATP 10.Inner C1AB ATP 1. About 9 and 10, C1AB is transfected one day before. 2. 2-10 is incubated with D609 for 6 hours. 3. 1067microl(97times11)HBSS is prepared 4. 33microl C1AB is put, means total 1100microl 5. 100microl pick up. Number1 6. 4microl D609 is put, total 1004 microl 7. Divide in half 8. first half, 5 microl ATP is added. 9. 100 microl pick up. Number2. 10. From remaining 400microl, each 100 microl is taken, add 1 microl PMA(10microM) and 1 microl DiC8 (100microM).Number 7 and Number 8. 11. About second half, 4microl ATP is added. 12. 100microl is picked up, Number3. 13. 1 microl U723122(15microM), R59949(10microM) or 2microl SMase(1unit) is added to each 100 microl, Number 4,Number5 and Number 6. Result In some part it is works well. But I missed to enter D609 in the cell which was supposed to be in the presence of U73122. So I need to do again about U73122. And My concern is C1AB probe expressed into the cells localized to the membrane in the presence of only D609. I need to chech this is really real or not. And I would be better to confirm that P2Y2R stay on the surface on the plasma membrane, by doing measure increase in calcium concentration. c 04/Mar/2011 I prepared WR19L cells, lymphocyte. I am gonna do the following experiments. I am gonna add 10 microM PMA, 100 microM DiC8, 12.5 units/ml Bc-PLC, 10 microM C6-Cer mixed with EYFP-C1AB probe. Experimental procedure WR19Lcells were spind down and collected. Cells were in total 815 microl(163microl*5 in each)HBSS solution. Add 25microl 3.8mg/ml EYFP-C1AB. 2microl 1mM PMA, 1mM alphaPMA, 100mM DiC8, 8.5microl of 12.5unit/ml Bc-PLC are put in the 1.5 ml tubes in advace. 168microl solution containing EYFP-C1AB is added in each tube and incubate 10 min. 30micro 20% PFA is added and fix for 10 min. After that, spine down cells and remove supernatant. Add 50mM NH4Cl for 5min. Spine down and suck up supernatant. Add 100microl HBSS. Result I could do it! I can see brighter fluorescence in PMA than that in control.About DiC8, It seems that there is no difference compared to control.About Bc-PLC, I could see very bright fluorescence in the cells which is aggregated, indicating that DAG is important for membrane fusion. 04/Mar/2011 I prepared WR19L cells, lymphocyte. I am gonna do the following experiments. I am gonna add 10 microM PMA, 100 microM DiC8, 12.5 units/ml Bc-PLC, 10 microM C6-Cer mixed with EYFP-C1AB probe. Experimental procedure WR19Lcells were spind down and collected. Cells were in total 815 microl(163microl*5 in each)HBSS solution. Add 25microl 3.8mg/ml EYFP-C1AB. 2microl 1mM PMA, 1mM alphaPMA, 100mM DiC8, 8.5microl of 12.5unit/ml Bc-PLC are put in the 1.5 ml tubes in advace. 168microl solution containing EYFP-C1AB is added in each tube and incubate 10 min. 30micro 20% PFA is added and fix for 10 min. After that, spine down cells and remove supernatant. Add 50mM NH4Cl for 5min. Spine down and suck up supernatant. Add 100microl HBSS. 18/Feb/2011 I am gonna follow Malhotra s procedure. I prepared the liposomes as follows. 1. POPC only=60 2. POPC/PS=60/20 3. POPC/GM1=60/20 These liposome includes 2mol% Rhodamine-PE 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. PS(0.04microl)avanti 100721 2.3mM 0.45 microl 3. GM1(0.04micromol) sigma G7641 1mM 1.128 microl 4. Phodamin-PE(4nmol) Avanti 0.15 mM 28 microl 1. I diluted these liposomes in 666microl, 888microl, 888microl in each. This means that 300 microM liposomes. 2. I am gonna pick up 100 microl in each. 3. EYFPC1AB domain is 1 mg/ml I am gonna add 1microl into 100 microl. This means that 10 microg/ml. 4. About DiC8, I have 1M DiC8 now (DMSO). I am gonna dilute this solution 200 times(PBS(-)), this means 5mM. Add 1microl into 100 microl. I want to prepare as follow. A. POPC B. POPC+probe C. POPC+probe+DiC8 D. POPC/PS E. POPC/PS+probe F. POPC/PS+probe+DiC8 G. POPC/GM1 H. POPC/GM1+probe I. POPC/GM1+probe+DiC8 5. FRET mesurement.30 min incubation. excitation 488 nm emission 500-650nm 6. Flotation assay (I can only use 4 samples for ultracentrifugation) B. POPC+probe C. POPC+probe+DiC8 H. POPC/GM1+probe I. POPC/GM1+probe+DiC8 7. Normalize with fluorescence of liposomes. 8. Apply sample solution to SDS-Page. 9. Stain with GFP antiboly. 06/Feb/2011 I couldn t make liposomes previously in 03/Feb/2011. However, I leave these lipid films for 1 week in the room condition. This might cause some bad effect on these membranes. So, I gonna make liposome again with same condition with littele modification. Because previous study use fluorescence PE was used 2mol%. I am gonna increase the volume of Rhodamine-PE from 0.5 to 2 mol%. So, 1. POPC only 2. POPC/DAG=60/6 3. POPC/DAG/GM1=60/6/20 4. POPC/DAG/PS=60/6/20 5. POPC/PS=60/20 6. POPC/GM1=60/20 Phodamine-PE is inluded all 2 mol%. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. PODG(0.033micromol) avanti 800815C 3.4 mM 9.8 microl 3. PS(0.04microl)avanti 100721 2.3mM 0.45 microl 4. GM1(0.04micromol) sigma G7641 1mM 1.128 microl 5. Phodamin-PE(4nmol) Avanti 0.15 mM 28 microl So then, I am gonna prepare following. 1. Take 102 microl POPC and 196 microl PE. 2. Mix and take 42.6 microl each in 6 tubes. 3. 9.8microl DAG is added 2,3,4 tubes. 4. 1.1microl GM1 is added 3,6 tubes. 5. 0.5microl PS is added 4,5 tubes. result I try sonication extensivly. But didn t make liposomes containing DAG even though biophysical journal paper shows that they could make liposomes. 03/Feb/2011 Lipid filmes prepared in 20/Jan/2011 was voltexed. But 5,6 didn t make liposomes. 2,3,4 did but rim of glass tube have fluorescence lipids, I am afraid of phase separation of DAG on the glass tube. Only 1 made liposomes well. 20/Jan/2011 I did the experiment of 09/Jan/2011 But this experiment didn t work well. Even positive control didn t work well, which is same result of ctrl. Toshi-sensei said that the distance between fluorescent PE and EYFP-C1AB doesn t become close enough. So I am gonna give up this experiment. I am gonna do following expeiment. I will prepare following liposomes. 1. POPC only 2. POPC/DAG=60/6 3. POPC/DAG/GM1=60/6/20 4. POPC/DAG/PS=60/6/20 5. POPC/PS=60/20 6. POPC/GM1=60/20 Phodamine-PE is inluded all 0.5 mol%. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. PODG(0.033micromol) avanti 800815C 3.4 mM 9.8 microl 3. PS(0.04microl)avanti 100721 2.3mM 0.45 microl 4. GM1(0.04micromol) sigma G7641 1mM 1.128 microl 5. Phodamin-PE(1nmol) Avanti 0.15 mM 7 microl So then, I am gonna prepare following. 1. Take 102 microl POPC and 49 microl PE. 2. Mix and take 21.6 microl each in 6 tubes. 3. 9.8microl DAG is added 2,3,4 tubes. 4. 1.1microl GM1 is added 3,6 tubes. 5. 0.5microl PS is added 4,5 tubes. 09/Jan/2011 I read a paper in which they made liposomes. I will modify a little bit. And I am gonna detect FRET signal. ex 488 nm, em 560 nm. 1.POPC/BODIPYPE(530/560)=60/0.6 2.POPC only (as ctrl) 3.POPC/PS/BODIPYPE(530/560)=60/6/0.6 (positive ctrl) 4.POPC/GM1/BODIPYPE(530/560)=60/6/0.6 5.POPC/GM1=60/6 (as ctrl) Each is divided into two samples. One is for ctrl. The other is for Bc-PLC addition. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. BODIPYPE(530/560)(0.004micromol) Molecular probe 1 mM 2microl 3. PS(0.02microl)avanti 100721 2.3mM 0.245 microl 4. GM1(0.02micromol) sigma G7641 1mM 0.564 microl 03/Jan/2011 I did the condition of 02/Dec. But this lipid mixture did not make liposomes more than previous condition. So Next thinking is that remove cholesterol. That menas that POPC/SM/DAG=60 20 10 and so on. And I did the experiment in which I see the effect of C1AB on cell growth. MDCK and HEK cells. I cultured HEK cells as following condition. cell concentration is 1.62*106 cells/ml. 10microl solution was added to 500microl medium. After that 10microl 3.8mg/ml C1AB was added. Ctrl is only 10microl 200mM imidazole buffer solution. About HEK cells, 3.0*105 cells/ml was prepared. 30microl this solution was added to 500microl DMEM solution. After that, 25microl 3.8mg/ml C1AB solution was added. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. brainSM(0.066micromol) avanti 860062C 31.4mM 2.1 microl 3. chol(0.2micromol) unknown 10.2mM 19.6microl 4. PODG(0.033, 0.066micromol) avanti 800815C 3.4 mM 9.8, 19.6 microl So, I made such liposomes. 1. POPC=60 2. POPC/DAG=60/5 3. POPC/DAG=60/10 4. POPC/SM=60/20 5. POPC/SM/DAG=60/20/10 6. POPC/SM/DAG=60/20/20 02/Dec/2010 It turns out that these lipid mixture I prepared in 30/Dec did not form liposomes. So, I asked Toshi-sensei how to make liposomes well. うえだくん、 コレステロールを増やせばうまくいくかも知れません。 POPC/SM/chol/DAG=60 20 60 10とか。 試してみてもらえますか？ 小林 So I made liposome as follows. 1. POPC(0.2micromol) avanti 13.7mM 14.6microl 2. brainSM(0.066micromol) avanti 860062C 31.4mM 2.1 microl 3. chol(0.2micromol) unknown 10.2mM 19.6microl 4. PODG(0.033, 0.066micromol) avanti 800815C 3.4 mM 9.8, 19.6 microl So, I made such liposomes. 1. POPC/SM/chol=60/20/60 2. POPC/SM/chol/DAG=60/20/60/10 3. POPC/SM/chol/DAG=60/20/60/20 30/Dec/2010 I prepared liposomes newly. SM was included because SM is important for distribution of DAG on the membrane. And then, I mimicked the outer leaflet of the plasma membrane. So, I used as follows 1. POPC(0.6micromol) avanti 13.7mM 43.8microl 2. brainSM(0.2micromol) avanti 860062C 31.4mM 6.3 microl 3. chol(0.2micromol) unknown 10.2mM 19.6microl 4. PODG(0.1, 0.2, 0.3,0.4 micromol) avanti 800815C 3.4 mM 29.4, 58.8,88.2,117microl So, I made such liposomes. 1. POPC/SM/chol=60/20/20 2. POPC/SM/chol/DAG=60/20/20/10 3. POPC/SM/chol/DAG=60/20/20/20 4. POPC/SM/chol/DAG=60/20/20/30 5. POPC/SM/chol/DAG=60/20/20/40 28/Dec/2010 EYFP-C1AB 1.77 mg/ml now (M.W=38,000) I took 3 microl this means 1.77 mg*3microl/1000microl=5.31 microg. So 5.31/38000=0.0001397micromol=0.1397nmol. 1 cell have 1 fmol DAG. glass base dish maybe has 10000 cells/1 well. So 1 fmol*10000=10pmol DAG. but outer DAG is less assume 1%. So 100fmol DAG. liposome 19mM DOPC 52.6microl this means 19 mmol/1000000microl*52.6microl=1micromol. 3.2mM DODG 12.5microl this means 3.2mmol/1000000microl*12.5microl=40nmol. These two are mixed, so 4%mol DAG. suspended in 200microl HBSS. 100microl picked up, means 500nmol PC 20 nmol DAG. vesicle contains two side, so 250nmol PC 10nmol DAG I did liposome experiment, but result is mysterious. In the presence of DAG in PC liposome, fluorescence light is brighter than that in the presence of only PC liposome. I think about this. Basically, I don t know what happen, but there is some hint. 1. cells were ripped off when both liposome was added, this means that PC works as detergent because I add a lot of liposome, 500 nmPC. So I need to reduce the amount of PC liposome. 2. In this experiment, I add 4mol% DAG in PC liposome. But other experiment, for example SM-lysenin, give 20mol% DM into PC liposome. So I can add more DAG, maybe at least 10%, possbly 20%-40%. As you know, If DAG included more, this membrane doesn t make a liposome. So I need to take care about it. Next time, I am goning to prepare the liposome, リポソームですが、1mMを1ml位用意して、 蛋白の濃度にもよると思いますが、 こちらの実験では、ＧＦＰ－Ｌｙｓの場合、 いつも、５０倍希釈で染色しているので、 (１マイクロ/５０マイクロＰＢＳ） １マイクロに、５０マイクロのリポソームを混ぜて、 ３７度で３０分してから、それで染色していました。 １ｍＭはかなり濃い濃度なので、タンパク質はすべて 結合すると考えています。 さっき探していた論文ですが、(準備中） For the preabsorption experiment, Dronpa-θ-D4 or Dronpa-NT-Lys was incubated with MLVs at 37°C for 30 min prior to apply them to HeLa cells. としか書いてありませんでした。 これで良いですか？ 牧野 Reply Forward Reply |Ueda Yoshibumi to Asami show details Dec 17 (7 days ago) リポソームを作るとき、はじめに、クロロホルムに溶けた脂質を遠沈管の中に加えて、 窒素で飛ばしてからPBSなどを加えてベシクルにするんだよね？ だいたい、クロロホルムに溶けた1mM脂質（例えばDOPC)を何μl位遠沈管に入れて乾かしていますか？ それは脂質のストック濃度によると思います。 １０ｍＭの脂質ストックなら１００ulだし、２０ｍＭなら５０です。 それで乾いてから1mlのＰＢＳをいれて、 最終濃度1mMリポソームが 1mlできるということです。 Show quoted text - Reply Forward Reply |Ueda Yoshibumi to Asami show details Dec 17 (7 days ago) １ｍMだったら脂質を１ｍｌ入れているっていうことだね。 かなり多い量を加えているんだね！ なるほど、わかりました。 Reply |Asami Makino to Ueda show details Dec 17 (7 days ago) でも、結局リポソームは５０マイクロＬとか使わないから、 1mlも作る必要ないと思う。 ２００マイクロでも作れば充分なんじゃないかな。 ただ、こちらにある脂質のストックはほとんど10mM以上あるので たくさんある脂質は少量はかり取るのが大変だから、 たくさん使ってもいいと思います。 Original Message ----- From Ueda Yoshibumi To Asami Makino Show quoted text - Sent Friday, December 17, 2010 3 31 PM Subject Re MLV なるほど、了解しました！ So, I prepared vesicles. I use 10microg/ml YFP-C1AB to stain the cells. YFP-C1AB M.W. 38kDa=38,000 This means 0.000263micromol/ml I add 100microl, So total amount is 0.02nmol. I want to include DAG into the vescle And then, 1 cells has 1 fmol DAG. glass based dishes is maybe 10 pmol DAG.
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HAPPY☆ANGEL(激) 曲名 アーティスト フォルダ 難易度 BPM NOTES/FA(SA) その他 HAPPY☆ANGEL jun with TAHIRIH SN 激11 180 363 / 2 STREAM VOLTAGE AIR FREEZE CHAOS 75 60 100 5 19 楽譜面(3) / 踊譜面(8) /激譜面(11) / 鬼譜面(-) 属性 渡り、同時踏み、ラス殺し、体力 譜面 http //www.ddr.sh/steps/basic/h/happy_angel/8m_happy_angel_a_d.html プレイ動画 http //www.youtube.com/watch?v=p-dyVP5c4Rk 解説 全体を通して休みが少なくやや体力譜面。BPM180での8分渡りは足11の中ではかなりの難易度。 -- 名無しさん (2009-12-27 14 29 54) 同時踏みは譜面認識力が足りないと余裕を持って踏めなくなり体力消費が激しくなる。読めない場合はハイスピの調整などで。 -- 名無しさん (2009-12-27 14 31 55) 全体を通しての同時押し、ラストの滝が11にしては難易度が高い、実力が背伸び気味の人はラスト台落ちに注意すべし。 -- 名無しさん (2010-03-20 12 57 07) ＳＰより交互に踏みやすく１６分２連こそ無いが、ＤＰは同時ラッシュや高速８分渡りなどあり遜色無い強さ。サビ手前のカズダンス８分は１Ｐ↑を踏み外しやすいので、足を伸ばすように意識すべし。高ＢＰＭで同時が多いので体力譜面の側面も強いが４分が多いということでもあるので、パフェ詰め段階になると判定の甘さも相まってかなりスコアを詰め易い -- 名無しさん (2014-03-08 23 16 01) 名前 コメント コメント(私的なことや感想はこちら) ↑ホンマに台落ちして閉店。めちゃ恥ずかしい… -- 名無しさん (2011-06-19 21 52 47) 一箇所ある付点8分と間奏の裏拍以外にリズムで難しい所はない。足運びも難しい所はないし、体力さえ持てばフルコンはそれほど難しくはない。 -- 名無しさん (2013-04-25 23 03 10) これ、体力属性つけても良いんじゃないかと。道中、休みなく跳ばされ踏まされた挙句、ラストで同時押し→渡り→カニと各１往復するのは足11の中でもキツい方だと思う。 -- 名無しさん (2013-10-12 05 20 06) SP(足12)は仮の姿です。 -- 名無しさん (2013-11-15 20 14 15) 足11にしては厳しい体力譜面。間に入る渡りも交互難で詐欺気味。ジャンプラッシュはヘビーローテーション(激)が見切れないとまず実力不足。体力にいたっては12はおろか13でも通じるLv -- 名無しさん (2014-03-14 12 43 41) スイスイに続く「junはドS」伝承第2弾。当時は超侍以降程は鬼畜ではなかったが体力の消耗度合いと言いやや速めの渡りと言い片鱗は見せていた。 -- 名無しさん (2014-12-01 23 34 57) クリア難易度は非常に高いがスコア難易度は非常に低く、足11でハイスコア狙いするクラスの人なら真っ先に鳥に乗る候補のひとつ。MFCも出されている。 -- 名無しさん (2014-12-04 08 00 46) 名前 コメント
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ステータス 初期値 LvMAX スコア 66 1144 スキル斜めライン状に高得点ルビィが出現するよ 必要ぷち数 35 35 範囲 S- LL- 特技終了10秒前からのコンボ数が追加されるよ 発動確率 5.0% 100.0% 効果 100.0% 100.0% スキルLv 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 必要ぷち数 35(変化なし) 効果範囲 S- S S+ M- M M+ L- L L+ LL- 必要スキルExp - 1 1 2 3 4 5 6 8 10 (累計) 1 2 3 5 8 12 17 23 31 41 入手方法 ガチャで入手 【えらべるチケット】（HAPPY PARTY TRAIN）と交換 解説 スキル「斜めライン状に高得点ルビィが出現するよ」 スキルの基本的な使い方に関しては、「スキル 特技」内の解説項目を参照。 同性能のスキル 黒澤ダイヤ (HAPPY PARTY TRAIN) - 特技はコンボ+（開始10秒） 黒澤ルビィ (HAPPY PARTY TRAIN) - 特技はコンボ+（残り10秒） ボイス パズル開始 頑張ろうね♪ パズル終了 お疲れ様でした♪ ショータイム 盛り上がっていこう！ スキル どこまでも続くよ！ 特技 応援してます！ ミッションクリア ミッションクリア！ 関連リンク スキル紹介（公式Twitter）
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IMC/W41-036 カード名：LET'S GO HAPPY!! カテゴリ：クライマックス 色：黄 トリガー：1・風 【永】 あなたのキャラすべてに、パワーを＋1000し、ソウルを＋1。 (風：このカードがトリガーした時、あなたは相手のキャラを1枚選び、手札に戻してよい) CR：輝いてぜったい だってぜったい 元気百倍の 未来へ！ レアリティ：CR SR RRR ・対応キャラ カード名 レベル/コスト スペック 色 凸レーション きらり 0/0 500/1/0 黄 凸レーション みりあ 2/1 1500/1/1 黄 凸レーション 莉嘉 3/2 10000/2/1 黄
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【登録タグ H VOCALOID めたはあ 初音ミク 曲】 作詞：めたはあ 作曲：めたはあ 編曲：めたはあ 唄：初音ミク 歌詞 時計の針が全て 12を指して揃っているよ 新しい一日が始まる 今日はとても特別で 喜びに満ち溢れているよ 私からのささやかな祝福 この想い歌に乗せて届けるよ Present for you！ Happy Birthday！ 誕生日おめでとう！ アナタの年齢の数だけ 立てたロウソク何本だっけ？ 一度に吹き消してみて 喜んでもらえたなら 私もとても嬉しくなるよ ニコニコ笑顔で朝を迎えよう 心込めて歌うから受け取って I sing my song for you！ Happy Birthday！ 誕生日おめでとう！ コメント この懐かしい感じのサムネと調声が癖になる！誕生日は毎年お世話になってます。 -- 藍瑠 (2019-10-25 10 42 53) ロウソクを消す時の息好き -- 名無しさん (2020-09-02 11 02 21) 名前 コメント