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抗体 / IgG4 ■ Class switch towards non-inflammatory, spike-specific IgG4 antibodies after repeated SARS-CoV-2 mRNA vaccination 「Science（22 Dec 2022）」より機械翻訳 SARS-CoV-2 mRNA ワクチンの反復接種による非炎症性スパイク特異的IgG4抗体へのクラススイッチ 概要 RNAワクチンは、SARS-CoV-2のパンデミックに対する有効な予防手段である。高レベルの中和SARS-CoV-2-抗体は、ワクチン誘発免疫の重要な構成要素である。最初の2回のmRNAワクチン投与後まもなく、IgG反応は主に炎症性サブクラスIgG1およびIgG3から構成される。2回目のワクチン接種から数ヵ月後、SARS-CoV-2特異的抗体は非炎症性IgG4で構成されるようになり、3回目のmRNAワクチン接種やSARS-CoV-2亜型の破瓜感染によってさらに増強されたことを報告する。スパイク特異的IgG抗体のうちIgG4抗体は，2回目接種直後の0.04％から3回目接種後期には19.27％に平均的に上昇した．このIgG4抗体の増加は，アデノウイルスベクターを用いた同種または異種のSARS-CoV-2ワクチン接種後には認められなかった．単細胞解析とフローサイトメトリーにより、3回のワクチン接種後、スパイク結合メモリーB細胞集団の中に、メモリーB細胞全体のレパートリー（中央値1.3%、IQR0.9-2.2%）と比較してかなりの頻度でIgG4スイッチのB細胞が存在することが明らかになった（中央値14.4%、IQR 6.7-18.1% ）。重要なことは、このクラススイッチが、抗体依存性の細胞貪食および補体沈着を媒介するスパイク特異的抗体の能力低下と関連していたことである。Fcを介したエフェクター機能は抗ウイルス免疫に重要であるため、これらの知見は、SARS-CoV-2に対する将来のブースター免疫など、mRNAワクチンを用いたワクチン接種レジメンの選択およびタイミングに影響を与える可能性がある。 はじめに 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）のパンデミックは世界中で5億人以上に達していますが、これまでにないスピードで新しい効率的なワクチンが開発され、数百万人の死亡を防いだと考えられています（1, 2）。2種類のmRNAワクチン（BioNTech/Pfizer社のComirnatyとModerna社のSpikevax）は、ヒトでの使用が承認された最初のmRNAワクチンでした。どちらも臨床試験(3, 4)や実環境(5-8)において、SARS-CoV-2感染予防に約90%という高い効果を示しました。いくつかの研究では、3回目の免疫後の抗体反応は、最初の2回投与レジメン後に測定された抗体反応と比較して、広範囲のSARS-CoV-2懸念変異体（VOC）に対する中和能力に関して優れていることが報告されています（9-11）。さらに、mRNAブースターワクチン接種後に抗体価が上昇することが示されましたが、これは胚中心（GC）の活性化の延長とB細胞の成熟が進行していることが一因であると説明されました。SARS-CoV-2ワクチン由来のmRNAとspike proteinは、ワクチン接種後数週間経過しても検出された(12)。メモリーB細胞のシークエンスにより、最長6ヶ月間GCで体細胞超変異（SHM）が起こり、メモリーB細胞レパートリーの拡大と多様化が起こり、VOCに対する効果が向上した（10, 12-17）。 Activation-induced cytidine deaminase（AID）は、抗体可変（V）領域のSHMを触媒する酵素です。GC B細胞で発現し、定常領域（C）遺伝子のクラススイッチ組換え（CSR）も媒介する（18, 19）。γ3 C領域がコードするIgG3は、第14染色体上の免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最も上流（5′）のCγ領域である（図1A）。AIDの継続的な活動により、より下流のCγ領域、すなわちIgG1、IgG2およびIgG4をコードするγ1、γ2およびγ4へのスイッチングが起こりうる（20, 21）。CSRは、免疫応答時に高度に制御される。B細胞が切り替わるC領域は、サイトカインやB細胞活性化因子によって、非配列型重鎖定数遺伝子の転写レベルで調節されている(21)。しかし、γ2およびγ4遺伝子座の生殖細胞転写に対する調節因子は、ヒトではあまりよく分かっていない。IL-4はIL-10と協調してIgG4へのスイッチングに関与していることが報告されている(22)。特にIgG2やIgG4は、抗体依存性細胞貪食（ADCP）、細胞傷害性（ADCC）、補体沈着（ADCD）などのFcを介した抗体エフェクター機能が低下するため、ほとんど非炎症性あるいは抗炎症性の機能を持つことが報告されている(20)。 図1. ワクチンによる抗体反応の経時的解析。 (A）ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の模式図。各機能的C領域（Cδを除く）の5′には、スイッチ（S）領域がクラススイッチの組換えを指示するように配置されている。ψで示された遺伝子セグメントは偽遺伝子に類似している（B）29人のボランティアは、表1に詳述したように、mRNAワクチンComirnatyを3回投与された。各ワクチン接種後（1回目、2回目、3回目）、および2回目接種後210日（2回目）、3回目接種後180日（3回目）の追跡調査時に、中央値で10日後に血清サンプルを収集した。3回目接種後と3回目接種後の間に10人が破たん感染を経験した（灰色の丸で示す）．異なるIgGサブクラスは、標準として組換えモノクローナル受容体結合ドメイン（RBD）-抗体を用いたフローサイトメトリーによって定量化された。各サブクラスのバックグラウンドの設定には、3つの陰性血清のMFI中央値を使用した。可視化のため、バックグラウンド以下のMFI値を持つすべての血清は0.1μg/mlに設定された。定量下限（LLoQ）は各グラフに点線で示されており、検出されたそれぞれの標準mAbの最低量を表している（IgG2、IgG3、IgG4は1.56μg/ml、IgG1は5.6μg/ml）。n.a.は未解析。明確化のため、統計的有意性にかかわらず、2回目以降、2回目以降、3回目以降の統計的比較のみを示した。(C）総抗S IgG応答の異なるIgGサブクラスの比率を、最後の4つの時点について示す。描かれているのは、各IgGサブクラスの平均値である。1つのグループ内の経時的な比較は、Kruskal-Wallis検定に続いてDunnの多重比較検定によって行われた。*p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001, ****p 0.0001, および n.s. は有意でないことを示す。 SARS-CoV-2- mRNAワクチン（ComirnatyまたはmRNA-1273）の2回投与後まもなく、IgG1とIgG3が優勢なIgGサブクラスであることが判明したが、IgG2反応はまれで、IgG4反応はほとんど検出されなかった（23, 24）。しかし、mRNAワクチン接種に対する4つのIgGサブクラス（IgG1、2、3、4）の縦断的進展、特に2回目と3回目の接種後の長期的進展は、まだ解析されていない。 ここでは、2回目のコミルナティのmRNA免疫後5～7カ月で抗スパイクIgG4抗体とIgG4スイッチメモリーB細胞が増加した、ワクチンを受けた医療従事者の独立した2つのコホートの分析について報告する。この反応は、3回目のmRNAワクチン接種および/またはSARS-CoV-2 VOCの画期的な感染によってさらに増強された。3回目のワクチン接種後、最近出現したOmicron VOCに対する抗体価の上昇と高い中和能を確認したが、遠位IgGサブクラスへの切り替えは、ADCPやADCDといったフラグメント結晶化可能（Fc）γ受容体（FcγR）仲介エフェクター機能の低下を伴うものであった。 結果 抗スパイク抗体サブクラス反応の経時的モニタリング 医療従事者29名のコホート（コホート1）において、コミルナティを3回接種したSARS-CoV-2ワクチン接種後の抗体反応を解析した（表1）。最初の2回の接種は3〜4週間の間隔で行われ、さらに2回目の接種から約7カ月後にブースター接種が適用された。フローサイトメトリーに基づく抗体測定法（25）を用いて、各ワクチン接種の10日後、2回目接種の210日後、3回目接種の180日後に血清中の抗スパイクIgG反応を測定した。以前の報告 (3, 4) と同様に、mRNA 免疫はすべての被接種者に強固な IgG 抗体反応を誘導した (Fig. S1A)．中和能をサロゲートウイルス中和アッセイで評価したところ、ワクチンによる抗体反応の動態が確認された（図S1B）。 表1. コミルナティ3回接種後の縦断的解析のための研究コホートの特徴 2回の免疫の10日後、サブクラスIgG1、IgG2およびIgG3の抗スパイク抗体は多重フローサイトメトリーアッセイで容易に検出されたが、抗S IgG4抗体は検出されなかった（図1B）。IgG2レベルは、IgG3およびIgG1レベルより著しく低かった。興味深いことに、2回目の免疫から210日後、スパイク特異的IgG4抗体のレベルは、約半数のワクチン接種者の血清で定量下限値を超えていた。他のすべてのサブクラスのレベルは、抗S反応全体から予想されるように、著しく低下した。 IgG4抗体レベルの上昇が、使用した相同mRNAワクチン接種レジメンに特異的であるかどうかを調べるために、我々は、コミルナティとアデノウイルスベクターベースワクチンChAdOx1（AZD1222、Vaxzevria）による相同および異種接種レジメンの免疫原性を比較した独立コホート（26、27）の血清を解析した（表S1参照）。2回目の免疫の5〜6ヶ月後、スパイク特異的IgG4抗体は、BNT-BNTコホートの半数の血清で再び検出可能であったが、他の2つのワクチンコホートの51の血清のうち1つのみであった（図 S2）。 3回目のmRNA免疫の後、すべてのIgGサブクラスの量は再び上昇し、IgG1およびIgG2の場合、2回目のワクチン接種の直後に測定されたレベルに達した（図1B）。IgG3は2回目接種直後の時点と比較して低レベルにとどまった．一方，IgG4抗体については，ほぼすべての接種者でブースター接種後に顕著な上昇が認められた．この時点まで，SARS-CoV-2感染を報告した者はおらず，血清検体のいずれからも抗核蛋白抗体は検出されなかった． 3回目のワクチン接種後の長寿命抗体プールへのIgG4抗体の寄与を解析するため、3回目のmRNAワクチン接種後、平均180日後に27人から追加の血清試料を採取した。この時点で、何人かの参加者は、核タンパクの血清学的検査と一致する異常なブレークスルー感染を報告していた（図1B、灰色の点）。注目すべきは、抗S IgGの全プールに対するIgG4抗体の相対的寄与が時間とともに増加し、3回目の免疫後に短命のプラズマブラストが一時的に拡大したことを否定していることである（図1C；図S1C）。4人の患者では、3回目の免疫後、IgG4が最も顕著なIgGサブクラスとさえなった。特に追加感染を経験した個体では、IgG4抗体は抗S抗体全体の40-80%を占めた(図S1C)。 SARS-CoV-2特異的メモリーB細胞におけるクラススイッチングの経時的モニタリング 2回目の免疫の後期に抗S IgG4抗体が出現したことから、長期間にわたるB細胞の成熟が進行し、遠位IgGサブクラスに対するCSRが高まり、その結果、IgG4スイッチメモリーB細胞が時間をかけて生成される可能性が示唆された。このような細胞の存在を血清学的検査以外で検証するために、2回目の免疫後、3回目の免疫後すぐ、および3回目の免疫後遅くに、抗S IgG4抗体の程度の異なる代表的な11人の縦断的PBMC試料を用いて、フローサイトメトリーによりスパイク特異的メモリーB細胞をそのIgGサブクラスに従って特徴付けた (Fig. 2)。スパイク結合B細胞は、CD27+メモリーB細胞集団にほぼ限定してかなりの頻度で検出された(Fig. 2A)。非スパイク結合メモリーB細胞中のIgG4発現メモリー細胞の頻度は、以前に記載したように1〜8％の範囲であったが（28）、スパイク結合メモリーB細胞の著しく高い頻度は、すべてのIgGサブクラスの37％まで達して、すべての時点においてIgG4を発現した（図2B；図S3）。血清学的データから予想されるように、IgG3は過小評価され、かなりの頻度でIgG2陽性のメモリーB細胞がスパイク結合メモリーB細胞の中に見られた（表S2）。 図2. SARS-CoV-2特異的メモリーB細胞におけるクラススイッチングの縦断的モニタリング。 コホート1の11人のボランティアからのPBMCは、指定された時点（2回目のフォローアップ後、3回目の10日後、3回目のフォローアップ後）でスパイク結合メモリーB細胞のIgGサブクラスの寄与について分析された。(A）CD19陽性、次にCD27陽性または陰性のB細胞（左パネル）、組換えスパイク-ネオンおよびスパイク-FusionRedタンパク質に同時に結合する（中央パネル）に対するフローサイトメトリーゲーション。CD27陽性および陰性B細胞中のスパイク結合細胞の割合は、右のパネルにまとめられている。(B）3つの異なる時点におけるスパイク結合メモリーB細胞と非結合メモリーB細胞のIgG4サブクラスの寄与をペアワイズで比較した。パーセンテージは、IgG4結合細胞と4つのIgGサブクラスすべての細胞の合計から計算された。* p 0.05, ** p 0.01, *** p 0.001; paired t-Test. フローサイトメトリー解析に加えて、4人の選択されたドナーのスパイク特異的B細胞のシングルセルRNA配列決定（scRNA-seq）を、2回目のコミルナティ投与から210日後または3回目の投与から10日後に実施した（図S4）。我々は、cellular indexing of transcriptomes and epitopes (CITE) -seq (29) を使用して、スパイクおよび受容体結合ドメイン (RBD) 結合B細胞を標識し、scRNA-seqの前にフローサイトメトリーによってスパイク結合IgG+ B細胞を濃縮した。フローサイトメトリーデータと一致するように、4人のドナーのスパイク特異的メモリーB細胞の16％がIgG4サブクラスをコードする配列を示し、非結合体ではほとんど検出されなかった。scRNA-seqを通じて決定された個々のドナーのIgG4抗スパイクメモリーB細胞の頻度は、それによって血清学的IgG4抗スパイクレベルを反映した（図S4B）。注目すべきは、同定されたすべてのスパイクおよびRBD結合B細胞のうち、IgG4サブクラスを有するB細胞は、他のIgGサブクラスを有するB細胞と表現型的に異ならないことであった（図S4C）。 IgG4産生B細胞クローンのスパイク特異性を確認するために（図S4D）、得られたB細胞受容体（BCR）配列から4つの組み換えモノクローナル抗体をクローニングし、真核細胞で発現させてRBDおよび全長スパイクへの結合について試験した。4つのモノクローナル抗体（mAbs）はすべてスパイクタンパク質に結合することができ、1つのクローンはRBDを認識し、これはCITE-seqの結果と一致した（図S4E）。 要約すると、フローサイトメトリーおよびscRNA-seqは、3回目の免疫の直前にIgG4スパイク結合メモリーB細胞の高い頻度を確認し、それはその後さらに増加した。 IgG4サブクラスは、破傷風トキソイドや呼吸器合胞体ウイルス感染の反復ワクチン接種後には優勢にならない 一般に、IgG4応答は、免疫や感染を繰り返してもほとんど観察されない。これを裏付けるために、我々は破傷風トキソイド（TT）ワクチンを数回（2-16、中央値6）接種したボランティア23人の破傷風特異的抗体反応を解析した（表S3）。血清は、ELISA形式を用いてTT特異的な総IgGまたはIgG4抗体について検査された。TT特異的IgG4は、23人中9人の血清で、非常に低レベルではあるが検出可能であり、受けたワクチン接種の回数との相関は認められなかった（図S5A, B）。さらに、コホート2（表1）の10人について、ヒトに定期的に再感染を引き起こす呼吸器系の病原体であるrespiratory syncytial virus（RSV）に対する抗体の有無を調べた。RSV-F蛋白質特異的IgG1抗体は、検査したすべての血清に認められたが、IgG4は検出されなかった（Fig. S5C）。これらの結果は、IgG4へのクラススイッチングは、ワクチン接種や感染症といった形で繰り返し抗原にさらされた場合の一般的な結果ではないという考え方を支持するものである。 SARS-CoV-2 mRNAワクチン接種者の独立したコホートにおいて、IgG4の発生は抗体の活性の上昇と相関するが、抗体のエフェクター機能は低下している。 当初記載したコホート1（表1，図1）の認識されていない偏りや特有の特徴を除外するために，非常に類似したワクチン接種スケジュールでコミルナティを3回接種したボランティア38人の第2のコホートを分析した（表1，コホート2）。このコホートでは，臨床的なブレークスルー感染がないにもかかわらず，核タンパクの血清検査で陽性を示した者が1人だけおり，機能試験に使用したより小さなサブコホートには含まれなかった。2回目または3回目のワクチン接種の直後（2〜5週間）に採取した血清は、前述の（図1）と同等のスパイク特異的抗体サブクラス分布（図3）を示した。ここでも、3回目の免疫後にIgG4（38.6倍）レベルの大幅な増加が見られたのに対し、例えばスパイク特異的IgG3は2回目の接種後に見られたレベルには達していなかった（図3A；図S6）。 図3. 2回または3回のmRNAワクチン接種後の機能的な抗体反応の比較。 コミルナティの予防接種を3回受けた38人の第2のコホート（表1、コホート2参照）から、ワクチン誘発抗体プロファイルを特徴付けるために10人を選択した（塗りつぶした円で示す）。このコホートでは、臨床的なブレークスルー感染がないにもかかわらず、ヌクレオカプシド血清学が陽性を示した人が1人だけおり、機能試験に使用したより小さなサブコホートには含まれなかった。2回目（2回目後）または3回目（3回目後）のワクチン接種後に採取した対の血清試料を分析した．フローサイトメトリーアッセイで測定したIgGサブクラス分布と全IgGの合計をコホート全体について示した（A）。RBD特異的IgG1およびIgG4の量（B）およびアビディティ（C）は、ELISA法により測定した。血中濃度測定では、血清は抗S IgGの総量で正規化し、等量の特異的IgGを使用した。三量体スパイクタンパク質への抗体の結合を測定するために、完全自動化CLIAアッセイを使用した。抗体レベルはWHO国際参照標準に従って定量され、BAU/mlで示された（D）。中和能力は、WTに対する代理VNT（E）およびオミクロンVOCに対する偽タイプVNT（F）において決定された。単球系THP-1細胞株（G）による抗体依存性貪食は、異なるサブクラスのモノクローナルRBD抗体（図S7）またはペア血清のいずれかを用いて分析された。貪食スコアは以下のように計算される。THP-1ビーズ陽性の％×ビーズ陽性の平均蛍光強度（H）。抗体依存性補体沈着は、ペア血清とインキュベートした後、スパイクコートマイクロビーズ上で分析した。C3沈着は蛍光標識抗体で検出し、補体負荷ビーズの平均蛍光強度を示す(I)。丸印は個々の血清を示し、実線は中央値を示す（H, I）。2つの時点の統計的比較は、paired T-testで行った。*p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001, ****p 0.0001, n.s. は有意でないことを示す。 抗スパイクIgG抗体の総量は、2回目のワクチン接種後と比較して3回目では中程度（1.6倍）にしか増加しなかったので、次に、IgG4抗体の割合の増加が機能的に影響を及ぼすかどうかを検討した。この目的のために、10人のボランティアの代表的なサブコホートのペア血清が分析された。まず、RBD特異的なIgG1抗体とIgG4抗体をELISA法で測定した。IgG4レベルは3回目のワクチン接種後に有意に増加したが、RBD結合IgG1のレベルは2つの時点で差がなかった(図3B)。また、3回目のワクチン接種後に結合能が明らかに上昇し（図3C）、これは最近の報告（9）と一致するものであった。さらに、ウイルス中和の代替指標となる3量体スパイクタンパク質の結合能（図3D）、可溶性RBDのACE2への結合阻止能（図3E）も、3回目の接種後に上昇していることが確認された。このことは、オミクロンVOC由来のスパイクタンパク質を偽陽性化したレンチウイルス（LV）粒子の中和に優れていることを意味します（図3F）。このように、ワクチン接種を繰り返すことで、可変ドメインを介した抗体エフェクター機能が向上することがわかった。 しかし、IgG2やIgG4はFcγR依存の二次エフェクター機能を媒介する可能性が低いと考えられている(20)。そこで、単球系THP-1細胞株（30）を用いてADCPアッセイを行った（図3G）。ターゲットとしてスパイクタンパク質を担持した蛍光標識マイクロビーズと、等量の当社リコンビナント抗RBD抗体を用いて、IgG3およびIgG1がIgG4およびIgG2よりも強力に貪食を誘導することが確認された（図S7）。FcγRIIA、FcγRIIBまたはFcγRIIIを発現するレポーター細胞（31）を用いて、IgG2およびIgG4の関与により、ADCPの主要メディエーターであることが報告されているFcγRIAの活性化が低下する（30、32）（Fig. S7）。これと一致して、3回目のワクチン接種後に採取した血清を抗スパイク抗体の量で正規化すると、2回免疫後の同じドナーの血清よりも有意に低い貪食スコアが得られた（図3H）。さらに、スパイクでコーティングしたマイクロビーズへの抗体依存性補体沈着も、3回目のワクチン接種後に採取した血清でインキュベートすると、有意に減少した（図3I）。これらのデータから、スパイク蛋白に反応するIgG2およびIgG4は、Fcを介したエフェクター機能が低下していることが示された。 ブレイクスルー感染症がワクチン誘発抗体反応に与える影響 また、mRNAワクチンを3回接種した後に破たん感染を起こした人が、コホート1において最も高いIgG4値を示したことから（図1）、SARS-CoV-2の感染によってもIgG4スイッチメモリーB細胞が活性化される可能性が示唆された。このことをより詳細に調べるために、破瓜感染の研究コホート（CoVaKo研究）から、SARS-CoV-2 mRNAワクチンを2回または3回接種し、2回目のmRNAワクチン接種後25日から257日、3回目のワクチン接種後57日から164日で破瓜感染を起こした12名を特定した（表 S4）。血清サンプルは、試験参加日（訪問（V）1、通常は最初の1週間以内）、および感染確認PCRの2週間後（V2）、4週間後（V4）に採取された。 全個体において、IgGサブクラスに関係なく、V1からV4にかけてスパイク結合抗体の増加を伴うアナムネティック抗体反応が検出された(Fig. S8)。これまでの知見と同様に、IgG4レベルは、2回のmRNAワクチン接種に比べ、3回のワクチン接種を受けた個体で一般に高かった。興味深いことに、ブレークスルー感染前にmRNAワクチンを2回接種したコホートでは、定量下限を超えるIgG4抗体を発現したのは3人だけであった。この3人は、2回目のワクチン接種後95日、201日、257日と、前回のワクチン接種との時間差が最も大きい時期に感染を経験したのに対し、他の9人では2回目のmRNA注射後25日から78日の間に感染が起こりました。このことは、IgG4への切り替えはGCの成熟が進行した結果であり、IgG4切り替えメモリーB細胞が出現するまでには数カ月かかるという仮説を支持するものである。 ディスカッション 本研究では、コミルナティを2回または3回接種したボランティアの抗体反応を、初回接種後少なくとも8カ月間縦断的に追跡しました。その結果、mRNAワクチンによってIgG4を発現するメモリーB細胞が拡大することを見出した。2回目の免疫後5～7カ月で採取した血清サンプルの約半数にスパイク特異的IgG4抗体を検出したが、それ以前の時点ではすべてIgG4を示さなかった。他のすべてのIgGサブクラスについては、同時期に減少が見られた。さらに、3回目の免疫後、IgG4レベルが急激に上昇し、ほぼすべての被接種者で検出可能になった。 IgG4抗体の出現は、現在進行中のGC反応と同様に、CSRとIgG4スイッチメモリーB細胞の成熟の連続したイベントの結果である可能性がある。IgG3抗体はあまり効率よく増強されず、2回目の投与で見られたレベルには達しなかった。14番染色体上の免疫グロブリン遺伝子複合体における4つのγ重鎖遺伝子（γ3-γ1-γ2-γ4）の順番を考慮すると（21）、近位IgG3から遠位IgG4への連続したCSRという仮説が支持されるだろう（33, 34）。興味深いことに、成人の免疫レパートリーでは、IgM/IgD細胞よりもIgG1 B細胞からIgG2またはIgG4へのCSRがより頻繁に起こることが報告されている(34)。 2回目接種後210日目、3回目接種後10日目、5ヶ月目にスパイク特異的記憶B細胞を分離したところ、フローサイトメトリーおよび単一細胞シークエンスにより、相当数のスパイク反応性、IgG4スイッチB細胞の存在を確認したが、IgG3陽性クローンはほとんど検出されなかった。ブースターワクチン接種直後のIgG4へのde novoクラススイッチングを正式に排除することはできない。しかし、その時点での血清中のIgG4抗体の存在は、IgG抗スパイク血清抗体の急速な上昇とともに、ブースター免疫によって既に存在していたIgG4メモリーB細胞が再活性化したとの考えを支持するものである。 破瓜型感染症のコホートでは、anamnestic IgG4抗体反応は、免疫と感染の間の時間間隔と相関していた。2回目のワクチン接種後70日以内に破局的感染を経験した人は、初診時に抗スパイクIgG4の血清レベルがそれほど高くなく、その後の観察期間中も有意に上昇しなかった。一方、2回目のワクチン接種後3カ月以降にブレークスルー感染が発生した場合には、抗スパイクIgG4が検出され、感染前に3回ワクチン接種を受けていた場合には、しっかりと検出された。研究対象者数が限られており、潜在的な交絡因子（初回ウイルス量、疾患の重症度、感染を引き起こした VOC など）の層別化は行っていないが、今回のデータは、mRNA ワクチンを 2 回投与した後に IgG4 スイッチメモリー B 細胞のプールがゆっくりと発達するという仮説と一致している。さらに、コミルナティmRNAワクチンを2回接種した後、抗スパイクIgG反応全体は同等であったものの、ヴァクシェブリア1次接種後にコミルナティを1回接種する異種免疫レジメンと比較して、IgG4レベルが有意に高いことも観察された。このことは、スパイクタンパク質への反復暴露自体が異常なIgG4反応を引き起こすという仮説に反している。コミルナティのmRNAワクチン接種または免疫の短い間隔が、観察された長期にわたるGC反応の原因であるかどうか、あるいはどの程度原因であるかは現在のところ明らかではないが（12-14）、リンパ節におけるワクチンmRNAまたは抗原の長期の存在は、可能な説明となり得るであろう（12）。さらに、mRNA ワクチン接種後、最長で 6 ヵ月間にわたる強固で持続的な T 濾胞ヘルパー細胞（TFH）反応が排出リンパ節で報告されており（17）、これは GC B 細胞と TFH 細胞の反復相互作用による CSR の制御に関与している可能性がある。注目すべきは、我々の研究は、Comirnatyワクチンの接種者に限定されていることである。コミルナティとmRNA-1273によって誘導されるスパイク特異的抗体の量と機能プロファイルはわずかに異なることが報告されているので（6、35）、mRNA-1273のワクチン接種を繰り返すことによって、非炎症性IgGサブクラスへの同様の切り替えが誘導されるかどうかを分析することは興味深い。 基礎となるメカニズムとは無関係に、抗ウイルスIgG4抗体の誘導は、あまり報告されていない現象であり、その機能的な結果について重要な問題を提起している。ウイルス粒子とその特異的細胞レセプターとの最初の結合を阻止する中和抗体は、SARS-CoV2感染に対する最も有効な防御手段であると考えられている(36)。この競合的結合は、可変抗原結合部位を介するものであり、Fc断片の定数部分には依存しない。実際、本研究では、3回目のワクチン接種後にワクチン誘導抗体のアビディティと中和能が向上するというこれまでの報告を確認した(9-11)。しかし、Omicron変異体による多くのブレークスルー感染症は、現在のワクチン接種レジメンが不妊化防止を付与していないことを示している。感染が成立すると、Fcを介したエフェクター機能がウイルス感染症の除去に大きく関係するようになる。全身血清学的アプローチにより、インフルエンザウイルス、RSVまたはSARS-CoV-2で示されたように、異なる抗体機能がウイルス病原体に依存して様々な程度の防御に寄与することが明らかにさえなっている(37-40)。動物モデルを用いた受動免疫試験により、モノクローナル抗体の適用によって得られる防御の程度は、そのIgGサブクラスに依存することがさらに証明されている（41-44）。この点から、IgG4は、ADCCやADCPなどのFc依存性エフェクター機能を媒介する可能性の低い抗炎症IgGと考えられている（20, 45）。 抗原特異的IgG4が高レベルであることは、IgEを介した効果を阻害することによるアレルゲン特異的免疫療法の成功と相関することが報告されている(46)。さらに、ハチ毒特異的IgG4は、養蜂家において数シーズンにわたって増加し、ついには特異抗原であるホスホリパーゼA (PLA) に対して支配的なIgGサブクラスにまでなっていることが検出されている。興味深いことに、IgG4反応は非常にゆっくりとした速度論が特徴で、出現までに数ヶ月かかる。一方、PLA特異的IgG1抗体はより早い時点ですでに測定可能であり、これは本研究で得られた結果と類似している(47)。さらに、特異的免疫療法（SIT）を受けている患者では、PLA特異的IgG4スイッチドB細胞の増加が観察された（48）。 これまでのところ、感染症に対するワクチンによるIgG4応答の役割に関する研究はほとんどない。HIVワクチンの開発分野では、VAX003試験（49）で繰り返しタンパク質を免疫したところ、HIV gp120特異的IgG2およびIgG4のレベルが高くなり、RV144試験（50）ではカナリアポックスベクター（ALVAC）と同じタンパク質ワクチンでプライムブースト免疫するとHIV特異的IgG3反応が高くなり、HIVに対する部分防御と関連した（51, 52）。さらに、ワクチンで誘導されたIgG3抗体はADCCやADCPなどのエフェクター機能を高めるが、ワクチンで誘導されたIgG4はそれらの機能を抑制した(52)。 ウイルス感染症の制御に関しては、ウイルス特異的IgG4抗体反応についてはほとんど知られていない。RSV特異的IgG応答で示したように、IgG4は急性呼吸器ウイルス感染症に繰り返し暴露されても、ほとんど誘導されない。麻疹特異的IgG4抗体は自然感染で誘導されるが(53)、HCMVのような慢性ウイルス感染症でも有意な特異的IgG4抗体は誘発されない(53)。 SARS-CoV-2の自然感染後のIgG4誘導に関する報告は非常に少ない。支配的なサブクラスは、ほとんどがIgG1およびIgG3であった(54-56)。しかし、パンデミックの初期にブラジルで行われた研究では、SARS-CoV-2感染後の発症の早さと抗スパイクIgG4抗体の高値は、より重症のCOVID-19進行と相関しており、これは抗体反応があまり有効でないことを示しているかもしれない(56)。さらに、Della-Torreらは、IgG4/IgG1比が高いことと予後不良との有意な関連について報告している(57)。しかし、一次免疫反応の場合、より重症の感染症がIgG4反応を引き起こし、その逆はありえないということもあり、因果関係を明らかにすることは困難である。 我々の研究では、3回目の免疫後の血清では、抗スパイクIgG4抗体の割合が高くなるのと並行して、抗体を介した食細胞活性と補体沈着が低下していた。しかし、これらの変化がその後のウイルス感染にどのように影響するかは、まだ不明である。Fcを介したエフェクター機能はウイルスのクリアランスに重要であると考えられるので、IgG4サブクラスの増加は、感染した場合にウイルスの持続時間を長くすることになるかもしれない。しかし、高活性抗体可変領域によってウイルスが中和されている間は、非炎症性Fc介在エフェクター機能が免疫病理学を低下させるということも考えられる。しかし、このような免疫病態を抑制する非炎症性Fcエフェクター機能は、ウイルスが高活性抗体可変領域を介して中和されている間、免疫病態を抑制する可能性がある。この点については、今後、重症度に差のある大規模なコホートが必要であろう。しかし、我々の結果は、その後の感染によってIgG4抗体レベルがさらに上昇し、一部の患者ではIgG4がすべての抗スパイクIgGサブクラスの中で最も優勢になることを明確に示している。 以上のように、本研究では、二次免疫後期にmRNAワクチンによる抗ウイルスIgG4抗体反応が発現することを実証した。今後、この反応を引き起こす正確な免疫学的メカニズムを解明し、IgG4駆動型抗体反応がその後のウイルス感染やブースターワクチン接種に影響を与えるかどうかを評価するために、さらなる研究が必要である。このことは、SARS-CoV-2に対する将来のワクチンキャンペーンだけでなく、他の病原体に対する新しいmRNAベースのワクチン開発にも関連している。 材料と方法 研究コホート コホートの詳細は、表1および表S1、S3、S4に記載されている。倫理承認はエアランゲンの地元倫理委員会（Az. 340_21B, Az. 46_21B, 350_20B and 235-18B）により与えられた。ドナーはすべてヨーロッパの白人系であった。 FACSベースの抗体 アッセイ FACSベースの抗体アッセイは、IgG、IgAおよびIgM抗体を検出するために、以前に発表されたアッセイを応用した(25)。ここでは、武漢株由来のSARS-CoV-2スパイクタンパク質をドキシサイクリン依存的に発現させた安定形質転換HEK293T細胞を標的細胞として使用した。スパイク特異的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4の定量を可能にするため、同一のRBD認識可変領域を持つ各サブクラスのリコンビナントモノクローナル抗体のクローニングと作製を行った。BCRの配列は、パンデミックの初期に感染者から分離したスパイク結合B細胞から得たものである。リコンビナントmAbsはHEK 293F細胞で産生された。精製されたmAbsは、試験血清中のそれぞれのサブクラスの絶対レベルの定量を可能にするために、各アッセイで標準曲線を作成するために使用された。結合アッセイでは、スパイクタンパク質の発現をドキシサイクリン処理で48時間誘導した後、1x105細胞を100μl FACS-PBS (0.5% BSAおよび1mMアジ化ナトリウムを含むPBS) 中の様々な希釈度で血清サンプルと4℃で20分間インキュベートして、表面のスパイクタンパク質と結合させた。洗浄後、結合した異なるIgGサブクラスのS特異抗体を以下の抗体を用いて検出した：マウス抗hIgG1-FITC (Sigma Aldrich,Cat# F0767, RRID AB_259409), マウス抗hIgG2-PE (SouthernBiotech Cat# 9070-09, RRID.JP), マウス抗hIgG2-PE (Sigma Aldrich,Cat# F0767, RRID.JP) AB_2796639）、ウサギ抗hIgG3（Thermo Fisher Scientific Cat# SA5-10204, RRID AB_2665317） に続き、抗ウサギ- IgG-AF647 (Thermo Fisher Scientific Cat# A-21443, RRID AB_2535861) とマウス抗hIgG4-Biotin (SouthernBiotech Cat# 9190-08, RRID AB_2796685) に続いて Streptavidin-PB (ThermoFisher, S11222) で洗浄を行いました。さらに洗浄後、サンプルをAttune NxTフローサイトメーター（ThermoFisher）で測定し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を用いて解析した。蛍光強度の中央値（MFI）は結合抗体のレベルと相関し、異なるサブクラスの標準曲線は、統計解析ソフトウェアGraph Pad Prism 9（GraphPad Software, USA）により4-Plプロットを用いて作成した。各サブクラスのバックグラウンドの設定には、3つの陰性血清のMFI中央値を使用した。グラフですべての血清を可視化するために、バックグラウンド以下のMFI値を持つすべての血清を0.1μg/mlに設定した。定量下限は各グラフに示されており、検出されたそれぞれの標準mAbの最低量を表しています。(IgG2、IgG3、IgG4は1.56μg/ml、IgG1は血清の1 100希釈で5.6μg/ml）。 RSV特異的抗体の検出のために、上記と同じプロトコルを適用して、RSV F-タンパク質のドキシサイクリン誘導性発現でHEK 293 T細胞を安定的に形質導入した。唯一の例外は、モノクローナルスタンダードアブがなかったことである。従って、MFIは、図の凡例にあるように、異なるバックグラウンド値でプロットされた。 三量体スパイク抗体の自動測定について 破瓜感染患者から採取した血清は、製造者の指示に従って、全自動LIAISONSARS-CoV-2 TrimericS IgG assay（DiaSorin, Saluggia, Italy）を用いて抗スパイク抗体の解析を行った。抗体レベルはWHO国際参照標準を使用して定量され、BAU/mlで示された。33.8 BAU/ml以上の抗体価を陽性とみなした。 サロゲートウイルス中和アッセイ[ 中和抗体の検出には、iFlash-1800 CLIA Analyzer (YHLO Shenzhen, China) を用いて、iFlash-2019-nCoV NAbアッセイをメーカーの説明書に従って実施しました。これは、SARS-CoV-2の受容体ACE2へのRBDの結合と競合することができる抗体を検出するものである。WHOの規格によると、中和活性はAU/mlで示され、陽性結果の線形範囲は10〜800AU/mlである。 抗原特異的抗体ELISA法およびアビディティ測定法 IgG1およびIgG4サブクラスのRBD特異的な抗体をELISAで分析した。この目的のために、ELISAプレートは、1ウェルあたり100μlの炭酸緩衝液(50mM炭酸塩/重炭酸塩、pH9.6)に100ngのRBDペプチド（Diarect GmbH, Freiburgにより提供）を4℃で夜通しコーティングされました。遊離結合部位はPBS-T（0.05% Tween-20を含むPBS）中の5%スキムミルクで1時間RTでブロッキングした。血清サンプルをPBS-T中の2％脱脂乳で1：100または1：1,000に希釈し、プレート上でRTで1時間インキュベートした。リコンビナントモノクローナルRBD抗体は、絶対定量を可能にするために標準として使用されました。200μlのPBS-Tで3回洗浄した後、抗hIgG1-ビオチン（Thermo Fisher Scientific Cat# MH1515、RRID：AB_2539710、希釈度1：2000）または抗hIgG4-ビオチン（SouthernBiotech Cat# 9190-08、RRID AB_2796685、希釈度1：5,000）をRTで1時間添加し、その後、HRP結合ストレプトアビジン（1：2,000、ABIN376335、ibodies-online． com)でインキュベートした。その後、プレートをPBS-Tで7回洗浄し、ECL溶液を加えた後、マイクロプレートルミノメーター（VICTOR X5、PerkinElmer）でシグナルを測定し、PerkinElmer 2030 Managerソフトウェアを使って解析した。 抗RBD抗体のアビディティを推定するため、血清の抗スパイク抗体含有量を正規化し、100ngの抗スパイク抗体をRBDアビディティELISAに使用した。このとき、抗原抗体複合体は、コントロールとして1.0Mチオシアン酸アンモニウムまたはPBSの存在下で、室温で30分間インキュベートした。低アビディティで結合した抗体を除去するために洗浄した後、ELISAは前記のように完了した。結合した抗体の検出には、HRP結合抗hIgGを使用した。相対的なアビディティ指数は、［IgG濃度（NH4SCN）／IgG濃度（PBS）］×100として計算され、パーセントで示される。 破傷風トキソイド特異的抗体の推定には、RBD ELISAと同じプロトコルを適用したが、0.5μl/ウェルの不活化TTワクチン（Tetanol Pur、Novartis）をコーティングに使用した。TT 特異的抗体の検出には、HRP 結合抗 hIgG または抗 hIgG4-Biotin (SouthernBiotech Cat# 9190-08, RRID AB_2796685, 希釈度 1 5,000) を用い、HRP 結合ストレプトアビジンとインキュベートした後、HRP 結合ストレプトアビジンを用いた。 シュードタイプ中和アッセイ 最近出現したオミクロンB1バリアントの中和は、前に記載したように、スパイク・シュードタイプ化シミアン免疫不全ウイルス粒子の助けを借りて評価した(58)。偽型レポーター粒子を製造するために、HEK293T細胞（RRID：CVCL＿0063）を、ルシフェラーゼをコードするSIVベースの自己不活性化ベクター（pGAE-LucW）、SIVベースの包装プラスミド（pAdSIV3）およびオミクロンスパイクエンコーディングプラスミドでトランスフェクションさせた。 偽典中和の評価のために、HEK293T-ACE2細胞を96ウェル平底プレートに2x104細胞／ウェルで播種した。24時間後、血清サンプルの連続希釈液60μlを、60μlのレンチウイルス粒子とともに37℃で1時間インキュベートした。HEK293T細胞をPBSで洗浄し、粒子-サンプルミックスを細胞に添加した。48時間後、培地を廃棄し、細胞を200μlのPBSで2回洗浄した。続いて50μl PBSと25μl ONE-Glo (Promega Corp, Madison, USA)を加え、3分後にルシフェラーゼのシグナルをマイクロプレート発光計（VICTOR X5, PerkinElmer）で評価し、PerkinElmer 2030 Managerソフトウェアで解析した。血清ID50の逆数をPrism GraphPad 9 (San Diego, California, USA)を用いてSigmoidal 4PL関数の適用により決定した。 FcγR活性化レポーターアッセイ FcγRのIgG依存性活性化を試験するために使用されるアッセイは、オプソニン化IgGが特定のFcγRを架橋することができるという条件で、Ag-IgG免疫複合体の存在下でマウスIL-2生産を刺激するキメラFcγR-ζ鎖受容体を安定して発現するBW5147（RRID：CVCL＿3896）レポーター細胞に基づく(31). まず、スパイクタンパク質でプレコートしたELISAプレート（InVivo BioTech Services GmbH, Hennigsdorf, Germanyの好意により提供）を使用して、異なるRBD特異的モノクローナル抗体の結合能を定量化した。異なるmAbの10倍連続希釈液（10μg/mlから0.001μg/ml）をプレートに加え、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、プレートをビオチン化抗ヒトIgGとインキュベート（1時間、37℃）し、その後洗浄、ストレプトアビジンHRPの添加（30分、RT）、TMB基質の添加を行った。結合は450nmでのOD値の測定と曲線下面積の計算により定量化した（AUC ELISA） FcγR活性化を測定するために、連続希釈したmAbをスパイクプレコートプレート上で37℃、30分間インキュベートした。プレートをRPMI10％（v／v）で十分に洗浄して非免疫IgGを除去し、個々のBW：FcγR-ζレポーター細胞（ヒトCD16A、CD32A、CD32B、CD64を発現）、ELISAプレート中に形成されたスパイク-IgG複合体に加え、37℃、5％CO2で16時間インキュベートした。その後、精製ラット抗マウスIL-2（BD-Pharmingen，）とビオチンラット抗マウスIL-2（BD-Pharmingen，1：500）を用いて、抗IL-2ELISA法によりマウスIL-2分泌量を測定した（31）。OD値を450nmで測定し、曲線下の面積を算出した（AUC IL-2）。上清中のIL-2産生量は、既報の通り定量した(31)。それぞれのFcγR活性化の指標としてのIL-2のレベルは、まずスパイク結合抗体の総量、例えばAUC IgG1 IL-2CD16/AUC IgG1 ELISAに対して正規化された。さらに、IgG2、IgG3およびIgG4サブクラスによる異なるFcγRの活性化を、IgG1 mAbによるそれぞれの活性化に対して正規化し、アッセイ間比較を可能にした。 抗体依存性貪食と補体沈着 貪食アッセイは、Ackermanら(30)を参考にした。黄緑色の蛍光ビーズ（FluoSpheres NeutrAvidin-labeled Microspheres, 1.0 μm; ThermoFisher, cat# F8776）にビオチン化SARS-CoV-2 S1 spike protein (GenScript, cat# Z03501）を5x108ビーズあたり100 ng proteinの割合でFACS-バファー (0.5% bovine serum albuminと1 nM azide sodiumを含むPBS）で4℃で夜通しコートした。FACS-bufferで洗浄後、96ウェルプレートの1ウェルあたり10μlのFACS-bufferで5x106個のビーズを播種した。モノクローナル、スパイク特異的抗体（1 ng mAb /well）またはそのスパイク特異的IgG濃度に正規化した血清希釈液（1 ng anti-S /well）を10 μl FACS-bufferの容量で添加した。血清は56℃で30分間熱不活性化した。37℃で2時間インキュベートした後、105個のTHP-1細胞（ATTC TIB-202、RRID：CVCL_0006）を、10％FCS、2mM L-グルタミン、1％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した100μl RPMI 1640の容量中のビーズに加え、プレートを37℃で16時間インキュベートした。細胞-ビーズ混合物を180μl PBSで2回洗浄（400xg、3分）した後、180μl 0.25% Trypsin/0.02% EDTAで10分処理した。FACS-バッファーでさらに2回洗浄した後、サンプルを200μl FACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーに供した。貪食は、まずTHP-1細胞にゲーティングし、次に貪食されたビーズの黄緑色の蛍光を示す細胞を選択することで評価した。貪食スコアは以下のように算出した。ビーズ陽性THP-1細胞の割合×ビーズ陽性の平均蛍光強度。 補体沈着アッセイは、(59)を参考にした。スパイクコートビーズを、貪食アッセイについて記載したように調製した。5x106ビーズを、U底96ウェルプレート中の20μl FACSバッファーの総容量において、そのスパイク特異的抗体濃度（100ng IgG/ウェル）に正規化した血清試料とともに、37℃で2時間インキュベートした。FACSバッファで2回洗浄した後、ビーズを、ウェル当たり10％FCSを補充した200μlのRPMIで1：50に希釈したギニアブタ補体（Cedarlane Lab, cat# CL4051）とともに37℃において15分間インキュベートした。さらに2回の洗浄工程の後、ヤギポリクローナル抗ギニアブタ補体C3 (MP Bio Cat# 0855371, RRID AB_2334449, 50 μl FACS-buffer 中 1 100) をビーズに加え、15分間 RTで洗浄した。その後、ビーズを2回洗浄してから、ロバ抗ヤギIgG H L-AF647 (Abcam Cat# ab150135, RRID AB_2687955) をRTで15分間添加した。補体の沈着は、さらに2回の洗浄工程の後、ビーズのAF647蛍光強度を測定することによって最終的に評価した。データはAttune NxTフローサイトメーター（ThermoFisher）で取得し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を使用して解析した。 末梢血単核細胞（PBMC）の分離と凍結保存 ワクチン接種者のクエン酸末梢血から、BioColl分離液、密度1.077g/ml（Bio SELL）を用いた密度勾配遠心法によりPBMCを分離し、熱不活性化FCS＋10％DMSO（Sigma-Aldrich）で冷凍して液体窒素保存とした。 スパイクプロテイン結合B細胞のフローサイトメトリー検出 フローサイトメトリーでスパイク特異的メモリーB細胞を標識するために、NeonGreenまたはFusionRedと融合した2つの三量体、前駆安定化スパイクタンパク質（60）による同時染色が用いられた。スパイクエクトドメイン配列は、効率的なトランスロケーションのためのBiPシグナルペプチド、スパイク特異的B細胞のフローサイトメトリー検出のためのFusionRed遺伝子、スパイク三量体の効率的なアフィニティー精製のためのC末端ダブルStrepタグをコードするpMTベクターにクローン化された。タンパク質の発現は、前に記載したように、ショウジョウバエSchneider 2細胞で行った(61)。3量体スパイクタンパク質を、Strep-Tactin Superflowカラム（IBA, Goettingen, Germany）を用いた上清からのアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、その後Superose 6 Increase 10/300 カラム（Cytiva）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。B細胞は、CD19-BV421 (BioLegend Cat# 302233, RRID AB_10897802), およびCD27-PE-Cy7 (BioLegend Cat# 356412, RRID AB_2562258) に対する抗体で染色された。IgGサブクラスの検出には、BV650結合抗hIgG1 (clone 6001, BD Biosciences) とウサギ抗hIgG3 (Thermo Fisher Scientific Cat# SA5-10204, RRID AB_2665317) を用いた2分割パネルに、抗ラビットIgG-AF647(Thermo Fisher Scientific Cat# A-21443, RRID AB_2535861）を両パネルに、抗hIgG4-Biotin (SouthernBiotech Cat# 9190-08, RRID AB_2796685) または抗hIgG2-Biotin (BD Biosciences Cat# 555874, RRID AB_396190) にBV510標識ストレプトアビジン (BioLegend, Cat# 405234) を続けて使用しました。 シングルB細胞シークエンス解析 スパイク特異的メモリーB細胞の標識には、FusionRedと融合した三量体、前融合安定化スパイクタンパク質（60）が使用された。 CITE-seqのために、製造業者の説明に従って、5′フィーチャーバーコード抗体コンジュゲーションキット-ライトニングリンク（Abcam）により精製スパイク-FusionRedタンパク質に固有の分子5′フィーチャーバーコードが加えられた。RBDも別のフィーチャーバーコードで標識した。 生きたCD19＋IgG＋スパイク-FusionRed結合メモリーB細胞を、FAUのFACS-Core施設内のMoFlo Astrios Cell Sorterで選別した。FusionRed陰性のCD19+ IgG+ B細胞も並行してソーティングし、スパイクでソーティングしたB細胞と混合した。FACS染色液には、サンプル同定のためのバーコード付きハッシュタグ（BioLegend）およびバーコード付きRBDも含まれています。Chromium Single-Cell 5′ Library Gel Bead and Construction Kit, v2 Dual index Chemistry Kit および Chromium Single-Cell V(D)J BCR Enrichment Kit (10x Genomics, CA, USA) を用いて単一細胞トランスクリプトームシーケンスおよび scBCR-sequencing 用ライブラリーを調製した。scRNA-seq, CITE-seq, VDJライブラリーはFAUのNGS-Core施設でIllumina HiSeq-2500プラットフォームで配列決定された。scRNA-seqリードは、Cell Ranger v6.1.2 (10x Genomics) を用いて細胞-遺伝子マトリックスを生成した後、ヒト参照ゲノムGRCh38 (UCSC, CA, USA) にアライメントした。scRNA-seq と VDJ-seq の解析には Cell Ranger v6.1.2 のマルチパイプラインを、表面特徴のカウントには CITE-seq-Count v1.4.5 を適用した(29)。データ解析はさらにR v4.2.0下のRパッケージ Seurat v4.1.1(62)を用いて進められた。ミトコンドリア遺伝子含量が高い（5%以上）細胞はフィルタリングで除外した。ダブレットおよび非標識サンプルは、サンプルハッシュタグを使用して識別およびフィルタリングされました。抗体VDJ遺伝子のさらなる解析には、IMGT/V-QUESTプラットフォームを使用しました(63)。 組換え抗体の発現 scRNA解析で得られたVHおよびVL配列から、合成gBlockを合成し（IDT）、クローニングにギブソンアセンブリーを用いた以外は、基本的にTillerら（64）の記載に従って、ヒトIgG1およびヒトIgκの発現ベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖プラスミドを293細胞にトランスフェクションし、トランスフェクション後3日目に上清から抗体を採取した。 謝辞 Andrea Schneider、Norbert Donhauser、Kirsten Fraedrichの優れた技術支援に感謝する。 資金提供 本研究は，バイエルン州科学芸術省のCoVaKo-2021，CoVaKo-Omicron，For-COVIDプロジェクトおよびドイツ連邦教育科学省（BMBF）の "Netzwerk Universitaetsmedizin", project "COVIM" (to T.H.W. and H.H.) によって資金提供された。T.H.W.はDeutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) からTRR130 (Project-No. 215346292) の範囲で資金援助を受けている。さらに、faculty COVID-19 fondsとGerman Centre for Infection Research (DZIF)からも支援を受けた。K.S.はBMBFの支援を受けている（プロジェクト01KI2013）。K.K.はDeutsche Forschungsgemeinschaft（DFG）の研究訓練グループRTG 2504（プロジェクト番号：401821119）およびElse Kröner-Fresenius-Stiftung（project 2020_EKEA.127 ）から支援されている。さらに、エアランゲン-ニュルンベルク大学病院のInterdisciplinary Center for Clinical Research（IZKF）より支援を受けた（advanced project A90）。研究助成機関は研究デザインおよびデータ解釈に影響を与えなかった。 著者による貢献 コンセプト立案。PS、CB、KU、KS、THW、MT。方法論。方法論：PI、JG、KK、DL、MW、SB、GS、TK、VF、ASP、KNM；HH、JH。調査 pi, jg, kk, dl, mw, sb, ss, kh, jz, gs, vf, cs, asp, knm, jh, ks, thw, mt. ビジュアライゼーション。JG; KK, DL, KS, THW, MT. 資金獲得 資金獲得：KU, KS, THW, MT. プロジェクト管理。KS; THW, MT. 監督。PS、CB、KU、KS、THW、MT。執筆 - 原案。原案執筆：KS, THW, MT. 執筆 - 査読および編集：全著者。 競合する利益 著者らは、競合する利害関係を有しないことを宣言する。 データ・資料の入手 本研究で得られた配列データは、Gene Expression Omnibus (GEO)のアクセッション番号GSE221320で利用可能である。B細胞scRNA/BCRデータはアクセッション番号GSE221316に、CITE-seqデータはGSE221319に関連づけられる。本研究で作成および/または解析された他のすべてのデータは、論文または補足資料に含まれている。 .
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ワクチン接種副反応 ■ The novel coronavirus’ spike protein plays additional key role in illness 「salk（April 30, 2021）」より機械翻訳 ■ 新型コロナウイルスのスパイクタンパク質が病気の発症に重要な役割を果たすことが判明 新型コロナウイルスのスパイクタンパク質が病気の発症にさらなる重要な役割を果たす。 ソーク大学の研究者と共同研究者が、このタンパク質がどのように細胞にダメージを与えるかを示し、COVID-19が主に血管の病気であることを確認した。 LA JOLLA発：科学者たちは、SARS-CoV-2の特徴的な「スパイク」タンパク質が、ウイルスが健康な細胞に取り付いて宿主に感染するのを助けていることを以前から知っていた。今回、このスパイクタンパク質（ワクチンで安全にコード化されたタンパク質とは全く異なる挙動を示す）が、病気そのものにも重要な役割を果たしていることが、新たな研究によって明らかになった。 2021年4月30日にCirculation Research誌に掲載されたこの論文は、COVID-19が血管疾患であることも決定的に示しており、SARS-CoV-2ウイルスがどのようにして血管系を細胞レベルで損傷し攻撃するかを正確に示している。今回の発見は、COVID-19の一見無関係に見える多種多様な合併症の説明に役立ち、より効果的な治療法のための新たな研究への道を開く可能性があります。 本研究の共同研究者であるUri Manor助教授は、「多くの人は呼吸器系の病気だと思っていますが、実際には血管系の病気です」と述べています。"本研究の共同研究者であるUri Manor助教は、「脳卒中を発症する人がいるのも、体の他の部位に問題を抱える人がいるのも、それで説明できます。これらに共通しているのは、いずれも血管が原因であるということです」と述べています。 ソーク社の研究者は、共同筆頭著者のJiao Zhang氏や共同シニア著者のJohn Shyy氏など、カリフォルニア大学サンディエゴ校の研究者と共同でこの論文を執筆しました。 今回の発見自体は驚くべきことではありませんが、論文では、このタンパク質が血管細胞にダメージを与えるメカニズムが初めて明確に確認され、詳細に説明されています。SARS-CoV-2が血管系に影響を与えることは、これまでも広く知られていましたが、その正確なメカニズムは解明されていませんでした。同様に、他のコロナウイルスを研究している科学者たちも、スパイクタンパク質が血管内皮細胞の損傷に寄与しているのではないかと以前から考えていたが、その過程が記録されたのは今回が初めてである。 今回の研究では、SARS-CoV-2の古典的な冠であるスパイクタンパク質に囲まれているが、実際のウイルスは含まれていない「疑似ウイルス」を作成した。この疑似ウイルスを動物モデルに感染させると、肺や動脈に損傷が生じた。これは、スパイクタンパク質だけで病気を引き起こすのに十分であることを証明している。組織標本では、肺動脈壁を覆う内皮細胞に炎症が見られた。 研究チームは次に、このプロセスを実験室で再現し、健康な内皮細胞（動脈を覆っている）にスパイクタンパクを投与した。その結果、スパイクタンパクは、ACE2と結合することで細胞にダメージを与えることがわかりました。この結合により、ミトコンドリア（細胞のエネルギーを生成する器官）に対するACE2の分子シグナルが阻害され、ミトコンドリアが損傷を受けて断片化された。 これまでの研究では、細胞にSARS-CoV-2ウイルスを感染させた場合に同様の効果が見られたが、スパイクタンパクを単独で感染させた場合に損傷が生じることを示したのは今回が初めてである。 ウイルスの複製能力を取り除いても、このACE2受容体、COVIDのおかげで有名になったSタンパク質受容体に結合できるという理由だけで、ウイルスは血管細胞に大きなダメージを与えることができるのです」とマナーは説明する。"変異したスパイクタンパク質を用いた研究をさらに進めることで、変異したSARS CoV-2ウイルスの感染力や重症度についても新たな知見が得られるでしょう」とManorは説明する。 研究チームは次に、破壊されたACE2タンパク質がミトコンドリアにダメージを与え、ミトコンドリアの形状を変化させるメカニズムを詳しく調べたいと考えている。 この研究の他の著者は、中国・西安の交通大学のYuyang LeiおよびZu-Yi Yuan、ソーク大学のCara R. Schiavon、Leonardo Andrade、Gerald S. Shadel、Ming He、Hui Shen、Yichi Zhang、Yoshitake Cho、Mark Hepokoski、Jason X. J. Yuan、Atul Malhotra、Jin Zhang（カリフォルニア大学サンディエゴ校）、Lili Chen、Qian Yin、Ting Lei、Hongliang Wang、Shengpeng Wang（西安嘉通大学健康科学センター、中国・西安市）。 本研究は，米国国立衛生研究所，中国国家自然科学基金，陝西省自然科学基金，国家重点研究開発プログラム，西安交通大学第一付属病院，および西安交通大学の支援を受けて行われました． DOI 10.1161/CIRCRESAHA.121.318902 .
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アポトーシス 作品名：Dies irae、神咒神威神楽 用語分類：種族分類 神座万象シリーズに登場する用語。 神格の持つ自死衝動。 または神格に近しい人物へと極小の確率で伝播しその神格を壊せる程の力を得る人物かその対神相性を指す。 詳細神格の自死衝動 神殺し 元ネタ 関連項目 関連タグ リンク 詳細 神格の自死衝動 神格の持つ自死衝動神を殺すために神の理に縛られない存在。 「私の渇望は壊れかけているのだよ。細胞の一つ一つが、もう耐えられぬと 慟哭している。俗に自滅因子と言うのだろうな」 「ゆえに私か、私にごく近しい君と深く関わった者は極小の確率でそうなっ ていく」 神殺し 神が死ぬための条件を満たす存在直接的、結果的、間接的限らず宿主を殺害するための行動を取る。自滅因子となった本人はほとんど無意識での行動である。 性別身近な人物を自滅因子にして神を殺すならば同性。 元々世界に誕生させておくならば異性として誕生する。 元ネタ アポトーシス（英：apoptosis）、ギリシャ：απόπτωσις 多細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種。 個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こされる細胞の自殺のこと。 関連項目 混沌より溢れよ怒りの日 水銀の蛇の自滅因子を宿した人物の 流出 無間身洋受苦処地獄 永遠の刹那の自滅因子を宿した人物の太極 Dies irae中では名称不明。 天照坐皇大御神 第六天の奇形嚢腫とその自滅因子から生じた太極。 宿主と癌細胞の関係を克服して生まれた理。 関連タグ Dies_irae 対神 用語 用語（種族） 神咒神威神楽 神座万象シリーズ 自殺衝動 リンク アポトーシス Wikipedia
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cGMPは動物細胞の中の2番目の重要なメッセンジャー。その機能はcAMPのものと同様に、明確に知られてはいないけれど。cGMPはグアニリルシクラーゼによってGTPから形成されて、ホスホジエステラーゼよってGMPに分解される。 （本章で以前に検討したことではあるが？）グアニリルシクラーゼは酸化窒素と一酸化炭素、およびペプチドリガンドによって活性化する。 これらのグアニリルシクラーゼの刺激は、生物反応によって伝えられ、cGMPのレベルを高めることを誘導する。血管肥大みたいに。 cGMPの反応は、依存するプロテインキナーゼの活性化によって頻繁に伝えられる。cGMPはイオン・チャネルを含んでいて、他の目標を調節するために反応することさえあるけれど。 cGMPの最も特徴的な役割が脊椎動物の目にある。 視覚信号を変換する 2番目のメッセンジャーが 光を得て？ 網膜の桿体細胞の中の光受容器はロドプシンと呼ばれるGタンパク質共役型受容体。 ロドプシンが、活性である、その時、小さい分子による？ 網膜の光の吸収、？？ロドプシンタンパク質における構造変化を引き起こす。 次に、ロドプシンはGタンパク質なんとか、を動かす。 そして、なんとか、のAサブユニットはcGMPホスホジエステラーゼの活動を刺激、cGMPの細胞内のレベル？の低下によって 網膜の桿体細胞の中のcGMPレベルによるこの変化は、細胞膜の中のイオン・チャネルでcGMPの効果によって、神経の興奮に変化される。においを感じるときのcAMPの機能と同様。
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ALSの病理 脊髄の側索(上位運動ニューロン)の萎縮と、前角(下位運動ニューロン)の運動神経細胞数の現象と残存細胞の萎縮とリポフスチン顆粒の蓄積が見られるが、後索は正常。またBunina小体が見られる。これは細胞内にHE染色で赤く染まる顆粒状封入体の事で、ALSに特徴的だが、意義はわかっていない。 ALSの画像MRIで錐体路が高信号を示す事がある。
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セラン・ブルーラビ スペースコロニー『嫦娥』の三人のリーダーの一人で、『蒼の長姉』の名を持つ高司祭。浅葱色の髪に赤い瞳の、鋭い目付きの小柄な女性。 武装神官隊の出身で、戦闘技能、特に射撃を得意とする武闘派 彼女が"嫦娥"を名乗っている間は運動大会や抜き打ち訓練など、軍事や運動に関する催しが増える。 + 実は… 初代教祖"嫦娥"の細胞から産み出されたクローン。 クローンではあるが、どこの細胞から産み出されるかで差異や個性が生まれる。彼女は『アキレス腱』の細胞から培養された。
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減数分裂 減数分裂は、人間では精子や卵、つまり子孫を残すための分裂です。 ちなみに、減数分裂は体細胞分裂のように、何回も分裂したりしません。 DNA合成準備期（Ｇ1期）～分裂準備期（Ｇ2期） 体細胞分裂と同じく。 分裂期（Ｍ期） ＝＝＝特徴＝＝＝ 分裂は二回行われるつまり、DNA量は母細胞の半分となる 第一分裂では、相同染色体が太合した二価染色体が見られる。 分裂は二回行われるつまり、娘細胞は4つできる。 第一分裂と第二分裂の間で染色体を増やさないので、染色対数は半減する。 （豆）DNAの複製 証明者：メセルソン・スタール DNA複製の課程： １、二重らせんが解け、RNAと同じ一本鎖となる。 ２、それぞれが鋳型となり、AとT、CとGのようなヌクレオチドがやってきて弱い結合をする ３、DNAポリメラーゼにより、ヌクレオチドが連結され、ヌクレオチド鎖ができてくる。 ４、完了。 この様な複製は、片方だけ古いものを使うため、 半保存的複製 と呼ばれる。
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10/6 まず、問5が欠番で問44が二問あります。すみません。 問1 問題の訂正です。 設問のa.リボソームはリボ核酸とたんぱく質からなり、、遊離リボソームと付着リボソームに分けられ、胎生期には後者が多い。 とありますが、〔胎生期に多い〕と記載してあるのは、昔の標準組織学（医学書院）にのみ載っており現在はこの説明は削除されています。とゆうことで、問1の設問はaは全て削除してください。 次に、①bのみ ②cのみ ③b,c ④d,e ⑤b,eとしてください。 解答は②のままで、説明はaの説明を削除してください。 問4 問題の訂正です。 解答の解説全て削除し b. 密着帯やギャップ結合に比べると著しく狭いというわけではなく、また物質の交流もしない。 c. 最上端に位置するのは密着帯（タイトジャンクション）である。 として、解説の10-7ページの下から4行目の興奮伝道や物質の交流を司る。これを、削除してください。 問10 解説の訂正です。 10-15ページの表の中の硝子軟骨の欄で、 ・年を取ると骨化 これを ・年を取ると石灰化 に訂正してください。 問16 解説の訂正です。 10-22ページの＜神経細胞の突起の数による分類＞の表の単極神経細胞の欄にある臭神経を削除し、双極神経細胞の欄に臭神経を加えてください。 問30 問題の訂正です。 ①a ②b ③c ④d ⑤e これを ①a ,b ②a,d ③b,d ④c,d ⑤d,e さらに、解答は②にしてください。 解説のdは正しいに訂正してください。 問49 問題の訂正です。 解答の解説で b. 馬の右葉には外側、内側の区別がある。 これを b. 馬の右葉には外側、内側の区別がない。 に訂正してください。 問56 問題の訂正です。 ①a ,b ②b,c ③c,d ④d,e ⑤a,e これを ①a ②b ③c ④d ⑤e にして、解答の解説 b. 山羊の外鼻は、鼻平面ではない。 これを b. 正しい。 に訂正してください。 問66 問題の訂正です。 解説の c. 一般の毛細血管と同様に内皮細胞と基底膜がある。 これを c. 有窓毛細血管（窓あき毛細血管）である。（p10-27参照） に訂正してください。 問84 問題の訂正です。 c. γ細胞はソマトスタチンを分泌し、グルカゴンおよびインスリンの放出を抑制する。 これを c. δ細胞はソマトスタチンを分泌し、グルカゴンおよびインスリンの放出を抑制する。 に訂正してください。
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同研究グループは、視床下部腹内側核ニューロンの中で、末梢組織の代謝に調節作用を及ぼすと考えられるSF1/Ad4BPニューロン(以下、SF1ニューロン)に注目し、その機能を調べた。SF1/Ad4BPニューロンの神経活動を選択的に高めるために、今回、DREADD法(Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drug)という、特定の神経細胞の神経活動を増加、および抑制できる方法を採用した実験を行った。 この方法によってマウスのSF1ニューロンを選択的に活性化すると、摂食量が低下して、熱産生が高まると共に、全身の糖利用が促進した。そこで、どの組織に糖の取り込みが高まるかを調べたところ、エネルギー消費器官である骨格筋、心臓、褐色脂肪組織用語説明3において選択的に糖の取り込みが高まることが判明した。脂肪を貯蔵する白色脂肪組織では、糖の取り込みは全く変化しなかった。技工機器 また、インスリンを投与すると、SF1ニューロンを活性化したマウスは、活性化しないマウスに比べて、糖の取り込みが骨格筋、心臓、褐色脂肪細胞において増加し、結果として、全身で見ても糖利用も顕著に促進した。骨格筋細胞などの細胞膜にはインスリン受容体蛋白質があり、インスリンがインスリン受容体蛋白質に結合すると、情報を細胞内に伝え、Aktなどいくつかの細胞内タンパク質を活性化して、糖の取り込みを促進する。今回の研究により、SF1ニューロンを活性化すると、インスリン受容体とAktが共に活性化することを見出した。実験結果から、SF1ニューロンを活性化すると、骨格筋によってインスリンの働きが高まり、その結果、糖の取り込みが亢進したと考えられる。虫歯診断装置 以上の実験結果から、SF1ニューロンを活性化すると、レプチンをマウスに作用させた時と同様に、摂食量や熱産生に作用を及ぼして抗肥満効果を引き起こし、まるで運動のように、糖取り込みの最大組織である骨格筋においてインスリンの働きを高めて、糖の取り込みを促進することが分かった。SF1ニューロンがどのようにして骨格筋でのインスリン作用を増強するかは、まだ明確には分かっていないが、別の研究から交感神経を介することが示唆される。 今回の発見は、肥満の病因解明、また2型糖尿病の原因と言われるインスリン抵抗性の発症メカニズムの解明と新しい治療法の確立に繋がることが期待される。 http //athena.kyo2.jp/e509279.html
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大豆１升炊き用（９ﾘｯﾄﾙ） 豆炊き味噌豆１升（１,４ｋｇ）がわずか２０分で炊ける 大豆１升＝１,４ｋｇ ９ﾘｯﾄﾙの鍋で炊く 味噌が健康に良いわけ 毎日の食生活が健康の基本 味噌はアミノ酸の宝庫 ・長生きのもと アミノ酸、リノール酸、サポニン、ビタミンEが抗酸化をうながし、血管や体細胞、脳細胞の老化を予防する。 ・生菌効果 乳酸菌、酵母などの160種もの微生物が善玉乳酸菌の増殖を助ける。 ・脳細胞活性 レシチンが脳細胞の老化を予防し、ビタミンEが血管を強くする。 ・抗ガン作用 大豆蛋白のトリプシン・インヒビターという有効成分が働くと言われている。 ・タバコの防害 ビタミンEがニコチンの害を防ぐ。 ・毒消し 微生物と大豆センイが体内の有害物質を排出する。ジピコリン酸が放射性物質を吸着排出する。 チェルノブイリの原発事故のあと周辺地域へ味噌が大量に輸出されました。 ①生大豆500ｇをよく洗い、約1Lの水に10～15時間つける。その際水は倍以上の高さで浸すこと。 麹に含まれる酵素 前述の通り、麹とは米や麦、豆等にコウジカビと呼ばれる一群の糸状菌(しじょうきん)を生育させたものであり、コウジカビが体外に分泌した酵素によりデンプン、タンパク質、脂肪などを非常に高い効率で低分子化することが出来る。