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質問対策 だいたいこんなもの? こんなかんじ。 こんなかんじ。 FLIMに最低限必要なこととは? 1.80MHzのパルスレーザー 2.高感度の光電子増倍管 3.ナノ秒オーダーで蛍光寿命を取得するハードウェア 脂質とプローブの関係はどうなっているのか? 普通培養細胞は、1plくらいだと考えられています。 スパインの中は0.1flから0.01flくらい 大体、100倍くらいだと考えられます。 大体、DAGは、1fモルです。一細胞に。 だから、10あぷとモルくらいある。(この計算はおかしい。神経の場合、スパインは特別だと考えられる) PIP3の場合は、その100倍くらい少ないから。100ゼプト盛るくらいあります。これが、刺激によって10倍くらいに変わるといわれています。 脂質プローブと脂質の結合能は、かなり高いですから、始めから結合していると考えられます。ここで、刺激が加わると、破壊分析の結果などを参考にしますと10倍から最大で50倍くらいの脂質ができます。これに、プローブが反応して応答するということになります。これは、プローブ全部を応答させるための量く シグナル伝達に関わるタンパク質は、タンパク質は、数十個あると言われている。よって、それに応答するPIP3も同様にそのレベルあるのではないかと推測します。プローブ分子は膜タンパク質で、蛍光を見ればわかるとおり、極めて量は少ないです。タンパク質の発現量は10-6Mくらいですから、スパインの容量が0.01flくらいだとすると、大体数十個くらいあると考えられます。よって、PIP3、プローブが大体数十個くらいずつあると想定してもらえれば大丈夫です。普通のPMTではなく、Gasp detectorを用いて観測しております。 1. In this presentation, you don t mention SHIP protein. How do you think SHIP protein is involved in this pathway? Thank you very much for good question. Exactly, SHIP is the protein that degrades PIP3 to PI(3,4)P2. I did not examine the effect of SHIP on spinule formation. Some paper shows that SHIP is not expressed in HP. Anyway it is very interesting to know the effect of SHIP on spinule formation. 1.0 How did you analyze spinule formation? It is pretty difficult that as you know spinule is very fine structure. So it is pretty difficult to observed. In our study we used the hamahoto H7422 Gasp detector. Spinules that protruded from the spine head were counted. Each synaptic spinule, regardness of its size and orientation, was scored as in previous studies (Tao-Cheng et al., 2009) And we did analyze the circularity. The effect of PTEN inhibitor, which increses PIP3, reduced the circularity. In the case of PI3K inhibitor, which decreases PIP3, there was the tendency that circularity increases but no significant difference. 1. 1. PIP3 or PIP2? very good question. This study is in the middle of revise. Reviewer pointed out about this point. I am looking for the protein of downstream of PIP3 such as Akt protein. And basically PIP2 is 100 times more than PIP3. even though PIP3 increase or decreases, PIP2 level is not reflected. So I think that PIP3 is the factor to regulate spinule formation. 1. 2. The relationship between schizophronia and PIP3 Inositol metabolism is deeply related to the depression and bipolar disorder. Because old days drug lithium is well known to work this pathway. currently it seems that lithium effects the GSK3beta. And PTEN mutant causes coden disease, which is accompanied by sometime mental reterdation. So PIP3 and inositol metabolism is related to the disease like these. But I think there is mainly two cause inositol metabolism regulates such a diseases. One is that PIP3 regulates the neuronal development in develop brains. The other is synapse function after neuron grown up. In the present study, I examined the effect of PIP3 on spine morphology. In near future, I want to examine the effect of PIP3 on neuron development. In some part, Dr. sheng reveal that PIP3 regulates the dendritic arborization though. 1.3 How about the mobility of PIP3 側方拡散lateral diffusion is roughly 1 microm/sec. But Dr. Kusumi shows that there is some barria mechanism which prevent the lateral diffusion of lipids. The molecules is surrounded by the fenses the size is 30 to 200 nm. So we cannot say that PIP3 is easily do the lateral diffusion. 1.4 PIP3 and raft Basically PIP3 fatty acid composition is steroyl and arachidonyl. 1.5 Did you try RNAi for PI3K and PTEN I tried PTEN RNAi. But I don t analyzed yet. 1.6 Did you check the decrease in PIP3 in the presence of PI3K inihibitor? Yes, I did it. I observed PIP3 reduction and increase in the presense of PI3K and PTEN inhibitor respectively in this figure. In the presence of PI3K inhibitor, PIP3 decrease more in spine than dendritic shaft. In the presence of PTEN inihibitor, PIP3 increase more in dendritic shaft than spines. Previously several paper shows that PTEN is localize in the dendritic shaft. Also some paper showed that PI3K is localized in spines and dendrites, but PI3K directly binds to AMPA receptors, leadting to PI3K activation. This data answers that why PIP3 is accumulated in the spines. 2. In the middle of glutamate uncaging, is PTEN related to this decrease? At first, I expect that PIP3 decrease during glutamate ungaging is due to PTEN. But I examined the effect of PTEN inhibitor on PIP3 decrease during glutatate uncaging. There is no obvious difference with or without PTEN inhibitor about PIP3 decrease. So I think this decrease of PIP3 is mainly due to menbrane insertion. 3. PTEN is dual phosphatase? Did you remove the possiblility PTEN phosphatase activity works in this pathway? Exactly PTEN has dual phosphatase activities. burabura. 4. PIP3 is involved in the functional plasticity? and structural plasticity? As I showd in introduction, there is no doubt that PIP3 regulates functional plasticity. 5. Does PIP3 regulate spinule length? Actually PIP3 regulates the number of spinule. But the length of spinule is not regulated by PIP3. 6. Explain the FLIM more. 7. What is the strength of FLIM compared to FRET? Previously I developed the ratiometric FRET probes including PIP3 and DAG probes. In the case of ratiometric-based FRET probe, in the thick tissues like hippocampal slice, wave-dependent fluorescence absorabance is gonna happen. We cannot measure appropriate FRET efficiecy. So I newly developed the florescence lifetime-based probe. Fluorescence lifetime never change even though thick tissues. That is the strength of FLIM. 8. PI3K works in the middle of glutamate uncaging? I did the experiment to see the effect of PI3K inhibitor on PIP3 concentration during glutamate uncaging. But there is no significant difference between with or without PI3K inhibitor. This means that enzymatic induced PIP3 is extremely little compared to dilution of PIP3 which is caused by membrane insertion. But if we want to observe more detail PIP3 dynamics which is caused by the PI3K or PTEN during glutamate uncaging, I plan to do this experiment as follows. At first I make the situation that spine size doesn t change even during glutamate uncaging using cytokarasin and catrunculin, which is inhibitor for actin polymerization. In this situation I am gonna measure the PIP3 increase or decerase. So I can observe real PIP3 change not induced by membrane insertion. 9. What is the down stream pathway of spinule formation? 10. What is the most difficult point for this work? How did you take over this problem? 11. What number of PIP3 is there in spine? Rough caluculation is 10-100 number of PIP3. How about the number and length of spinule ? raft and PIP3. my probe is subjected with palmitoyl and farnesyl modification. Recently raft proteins clustering regulate the localization of N-Ras. At least I get the response of FLIMPA3 in culture and neurons. The important proteins including PI3K is localized in raft. So PIP3 also localized in raft. But it is very interesting to discriminate the PIP3 production or reduction in raft or non-raft. 神経細胞の樹状突起には約1万個のシナプス結合があります。人が記憶する前と後で、脳の中で何かが変わっているはずです。実際、シナプスで電気の通り方などが変化することから、この一つ一つのシナプスは記憶の最小素子だと考えられています。故に、個々のシナプスの特徴を知ることは、記憶のメカニズムを探る上でとても重要です。個々のシナプスは、入力をうける神経細胞から別々に入力を受けるので、独立に働いていると考えられる一方、クロストークという減少もあります。これは、一つのシナプスに入力が起きたときに、隣接するシナプスに影響を及ぼし、隣接するシナプスで入力を受けやするするということであります。 スパインがクロストークすることはどのような意義があるのでしょうか?りんごというものを覚えたとしましょう。そのときにあるシナプスが活性化し、その付近のシナプスとクロストークします。そのときに、りんごの性質、あかい、おいしいなどの情報が近くに入力しやすくなれば、今度思い出すときに、効率がよいと考えられる。シナプス間のクロストークは、このような思考の分子レベルでのモデルとなるのではないか?と考えております。 クロストークを引き起こす因子として、従来からいろいろな因子が報告されてきました。一酸化窒素、アラキドノイルグリセロールなどの因子は、細胞膜を超えて、隣のシナプスのシナプス前膜に作用するなどの報告がありました。2007年にラスたんぱく質が樹状突起を通って、隣のシナプスに作用することが報告されました。私は、このシナプス間のクロストークに関わる因子の一つとして、脂質シグナルがあるのではないかと考えました。脂質シグナルは、シナプス前膜からグルタミン酸が放出されるとシナプス後膜のグルタミン酸受容体が活性化し、PIP2からホスホリパーゼCによって、DAG,PI3KによってPIP3が産生されます。DAGは、神経細胞の分化などに関わるシグナル、PIP3は、アポトーシスに関わるシグナルを制御することが知られています。 脂質シグナルだと考える根拠は、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置すること、特にPIP3は、グルタミン酸などの刺激入力を受けた後、分解されずに数時間持続することが知られ、1秒間に0.5マイクロメートル側方拡散され、隣接するシナプスに到着することができるからです。この結果、この脂質シグナルが、隣接するシナプスに移動し、隣接するシナプスに入力を受けやすくなるのではないかと考えました。 では、どうやってこの脂質シグナルを測るかですが、従来までの脂質シグナルの測定法は、破壊分析に頼っていたために、一個一個のシナプスの個性を失っていました。そこで、生きた神経細胞で見るために、私が現在までに開発したFRETプローブ分子を用いようと考えております。このプローブの特徴は、2つあります。1つは、脂質結合ドメインを変えることによって、様々な脂質を見ることができること。従来までに、DAGおよびPIP3のプローブを作ってきました。2つ目は膜に局在していることです。従来までに、脂質を見るためのプローブ分子として、GFPと脂質結合たんぱく質の融合プローブがよく使用されている。脂質が細胞膜で増加した際、プローブ分子が膜に移行することによって増加を確認できる。しかしながら、スパインおよび樹状突起は細胞体とつながっており、脂質プローブがスパインまたは樹状突起の膜に移動した際、細胞体にあるプローブがスパインに流れ込み、バックグランドのノイズとなる。申請者のプローブ分子は、膜に局在しているために、バックグランドがないため、スパインおよび樹状突起での脂質の動態を見るために優れている。これは、脂質シグナルをシナプスにおいて観察することができる能力を有しております。 実験においては、この作製した脂質FRETプローブを海馬スライスに遺伝子銃によってトランスフェクションします。次に、詳細は省きますが、自作の2光子顕微鏡を用いて、神経細胞を観察します。図のように樹状突起およびスパインが観察されます。 次に、プローブを発現した神経細胞のひとつのシナプスを刺激します。顕微鏡下で、神経細胞はこのように観察されます。2004年にひとつのシナプスを刺激する方法が開発されました。まず、グルタミン酸前駆体をインキュベートします。一つのシナプスの近傍に光刺激を行うと、この限られた範囲でグルタミン酸が産生され、シナプスが刺激されます。これによって、脂質のシグナルがどのように起きるのかを観察します。また、図を観察すると刺激を受けたスパインだけ大きさが大きくなっていることがわかります。シナプスはある一定以上の強さの入力を受けることで、このように大きさを変えます。これは、このシナプスがこの入力を記憶したということを示しています。申請先研究室では、このシステムをいち早く取り入れ、80%以上の確率でシナプスサイズを変えることが可能であります。 そこで、一年目では、2光子顕微鏡のセットアップを行う。それと同時に、PIP2,DAG,PIP3のプローブ分子をFLIMプローブに変える。 2年目では、一つのシナプスを刺激し、脂質シグナルがどの程度、どのくらい樹状突起まで伸びていくのかなどの、基本的な情報を得ます。時間的には、グルタミン酸産生に伴い脂質シグナルが活性化しPIP2は、基質であるために、減少し、DAGおよびPIP3は増加すると考えられます。しかしながら、DAGは破壊分析の結果から一過性、PIP3は、持続すると期待できます。 2年目は、脂質シグナルが届くシナプスと届かないシナプスに刺激を与え、光刺激がどの程度の刺激の強さで、スパインの大きさが変わるかを調べます。 脂質シグナルが届く範囲のスパインは、より弱い光刺激で大きくなるのではないかと期待します。 次に、脂質の移動を止めるために、セプチンたんぱく質を強制発現します。発現します。このたんぱく質は、図のようにスパインネックに発現します。緑がGFPセプチン、赤は神経細胞の形状のマーカーです。セプチンは3nmほどのたんぱく質でこれらがオリゴマーを形成し、スパイン脂質の移動を阻害します。この状態で、一つのシナプスを刺激します。すると脂質の移動は阻害されますから、隣接するスパインの大きさの変わり方は、遠くのシナプスと変わらないのではないかと推測できます。 この実験によって、脂質シグナルがシナプスのクロストークに必要であるかを検証します。 本研究では、 申請者が現在までに培ってきた脂質の知識 および蛍光プローブ分子を現所属研究室に導入する 現研究室にある2光子顕微鏡グルタミン酸光分解システムを用いる。 スパインにグルタミン酸刺激を与えたときに、 脂質分子のスパイン内および樹状突起上での広がりを観察する 脂質分子の移動を阻害することで、脂質シグナルが、隣接するシナプスにどのように影響を及ぼすのかを探っていく MIT時代には何をやってきたのですか? クロストークをとめたら連想がとまった。 脂質シグナルをとめたら連想することができなくなった。 個々のシナプスで引き起こされるシグナルは、シナプス内で留まることも予想されるが、近年、一つのスパインの変化が、隣接するスパインに影響を及ぼすことが報告されている 従来までのシナプスでのシグナル伝達を調べる方法としては、シグナル伝達の阻害剤と電気生理的手法を用いた結果が主であり、一万個存在するシナプスの総和から得られた情報である。 How much does enlargement of spine happen? How much does lipid second messenger is there? Is it right to tell lipid signaling as controller of signal? What is the function of septin? Septin is discovered in1971 in budding yeast mutants defective in cell-cycle progression. If you overexpress the septin, not only lipids but also the protein, which localize in membrane, is stopped by the septin, right? I need to prepare the septin, which have mutant ATP binding site or mutant enzyme activity delation mutant. You should learn the mechanism the pathway until producing lipid second messenger. ラフトによって、もっと上流のたんぱく質は動くことがないのではないか? Gたんぱく質はそるブルだから大丈夫。しかし、Gbrは膜局在型。代謝型グルタミン酸受容体はどのGたんぱく質を活性化するのか?また、PLCデルタ、PLCβは泳ぐが大丈夫か? 脂質の組成がミックスしないようにたんぱく質がバリアを作っているということは結構ある。らてらるとばそらてらる。 でんどらいとにのみ発現しているようなたんぱく質はないだろうか? What size is lipid? ゴーシュ型でC-C 1.513; C-H 1.112 Å アンチ型でC-C 1.511C-H 1.112 Å 大体DAGは5Å, 10Å PIP3は10Å, 10Å PTEN, DGKをノックアウトしたらどのくらいまで伸びるのか? どれくらい脂質は産生するの? 本当に脂質はシグナルの司令塔なの? 西塚先生を出す。 デイビッドホロビンを出す。 脂質って細胞膜からどれくらい出ているのか?PIP3だったら15nm以上は出ていると思う。 もし、始めから脂質の移動が阻害されていたらどうする? 確かに、CaMkIIはスパインでのみ活性化されることが知られている。 しかし、Rasは結構長く伸びることが知られている。 脂質の移動を阻害するものの有力なものとして、セプチンがあげられるのですが、エンドジーニアスなセプチンもあります。ただ、結構、すべてのスパインネックに存在しているわけではなく、もしかしたら、脂質の移動を変えるような働きをしている可能性があります。クロストークに選択性があるということでとても面白いということになります。 脂質シグナルをスパインで見ることの重要性。 何故、スパインが記憶の最小素子となるのか? 何故あなたは脂質シグナリングを選んだのか? 1.脂質シグナルは移動することができるシグナルの最上流である。 2.脂質シグナルの特にPIP3シグナリングはしばらくの間持続する。 PKCの局在を見てみるとデンドライトでも起きている。やっぱり脂質は移動していると考えられる。 実は、かれるによって、らすシグナルが閾値の上昇に必要だということがわかっている。しかしながら、何故ラスなのか?実は、ラスはPIP3の下流なんですよね。 PTENの局在。 DGKの局在。DGKはカルシウムによって活性化されるが、神経細胞でのカルシウムの上昇は瞬時である。 これによって、あるシグナルに反応しやすくなるようになり、ある反応に応答するシナプスクラスターができるのではないだろうか。 シナプスのクロストークに脂質シグナリングが関係していなかったら? 脂質修飾のメカニズムについて。 PIP2の局在は?下の論文にあるように恐らく均一に存在する。 しかし、結局のところ活性化されたグルタミン酸受容体がどこにあるかが重要でさらに、活性化したPI3KとPLCがどこにあるかによる。 Neuroscience Letters 423 (2007) 158–161 もしかするとPLCやPI3Kがデンドライトまで泳いでいって、PIP2を代謝することはないのか? 恐らくないと思う。その根拠は、代謝型グルタミン酸によって活性化されるPI3Kはp110rだと考えられます。 このたんぱく質は、脂質修飾を受けているたんぱく質とコンプレックスを作っている。 もしかしたら他の脂質修飾されていないようなたんぱく質がPIP3を作る可能性があるかもしれないよ。 そしたら、それは、わかりません。ただ、ここで重要なのは、PIP3ができて、それが樹状突起を移っていくことが観察できればいいのだと考えております。 PI3kは1,2,3型が存在する。そのうちPIP2を基質とするものは、I型だけである。一般的なI型のA型は、チロシンリン酸型受容体によって、活性化される。一方、I型のB型は、p110γであり、これは、Gたんぱく質共役型受容体によって活性化される。Brとアダプターたんぱく質のp101と複合体を形成する。このため、かなり移動度が遅いと考えられる。よって、PIP3のような低分子の方がかなり早く動けるのではないかと考えております。 よって、PIP3の量は、PTENとPI3Kのバランスで決まっている。しかし、 PIP3を作り出す刺激は、グルタミン酸受容体だけなの? いえ、恐らく他にもあるとかんがえられます。しかしながら、今回絞っているのはグルタミン酸受容体だけです。 DGKはどこにいるの?細胞質中にいますが、DGKは、9つのアイソフォームがあって、α、βは、PSD結合ドメインを持っていないが、γ、ζはもっている。基本的に、デンドライトシナプスにいるが、後者は、PSDに濃縮されている可能性もある。 別にあなたのプローブじゃなくてもサイトゾルプローブで赤と緑比較してできるんじゃないの? 実は、それでは難しいです。というのは、仮に、フレットプローブと膜局在プローブが培養細胞などで100%応答した場合どちらも、最高の状態となります。しかし、神経細胞においては、デンドライトと繋がっていますから、さらに、プローブが入ってしまうわけです。すると、膜局在方はこの赤と緑がバックグランドとなって、感度が小さくなってしまうということがあげられます。よって、FRETプローブの方が応答はよいであろうと考えら得ます。 mGluRによって活性化されるPI3Kとして、IB型が挙げられる。これは、Gbrによって活性化される。 ちなみに、NMDA依存的にPIP2が減少する系も存在する。これには、2つの可能性が挙げられる。PLCが泳いでいった。もしくは、樹上突起にも受容体が多少なりとも存在し、それが活性化した。しかし、今調べたいのは、スパインから産生された脂質分子であるから系が全く違うと考えられる。 PIP3は、様々な方法で産生されると考えられる。スパインにはチロシンキナーゼ受容体EPH受容体なども存在するだろう。だから、PIP3が産生されるメカニズムはたくさんあると考えられる。しかしながら、今回はグルタミン酸受容体を考えているからそれによって活性化されるのは、代謝型グルタミン酸受容体だと考えられる。 もしかすると、brが移動するかもしれない。しかしながら、脂質とGたんぱく質どっちが移動が早いかというと、grの方が大きいから移動しづらいと考えられる。 Rasの活性化は、11microm//4 minである。とても遅い。結局、上流のシグナルがどうなっているかについての情報は何も与えないことになる。 クロストークを行うと何がいいのか? スパインネックが見えないんだけれどどういうこと?本当にくっついているの? 何分後に刺激をするの? どんな点が困難だと考えられるのか? 逆に、スパインで制限されたらどうするの? 答。もちろん計画を立てるときには一番面白い作業仮説をたてるわけであります。それはそれで面白いと考えられる。その一つとしてセプチンが上げられます。 普段から脂質はセプチンによって抑えられているんじゃないの? セプチンは、細胞質のたんぱく質の拡散も防ぐんじゃないの? それは、GFPを発現させてホトブリーチすればよい。 それを調べるためには、セプチンRFPを発現させて本当にセプチンが阻害するかを調べればよい。 スパインの大きさってどれくらい? シナプスのクロストークにプラスマイナスはあるのか? タイトルはゴシックにする。 申請者の利点はちょっと変えるべき。 何故FRETを使うか?理由を述べる、 脂質シグナルをわからせる 10出たものが拡散してしまうと3になってしまう。それでよいのか? セプチンの情報 あるセプチンは、PIP2などとくっついて膜のbracingを起こす。Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Tanaka-Takiguchi Y, Kinoshita M, Takiguchi K. Curr Biol. 2009 Jan 27;19(2) 140-5. DiIは分裂溝を通る。 ただ、Dilは細胞膜の表面に入ることから表側である可能性が高い。 細胞膜の成分をミックスしないで、そのまま分けるという役割を持っているたんぱく質の一つにセプチンというたんぱく質があります。セプチンは、主に細胞分裂の際に分裂溝にセプチンリングを形成し、細胞分裂に必要なたんぱく質です。また、細胞膜上の成分をミックスしないようにしているからです。 ですので、 スパインのコンパートメントについて カルシウムは、シナプスで制限される。 CaMKIIも同様に制限される。 しかしながら、Rasたんぱく質は制限されずに、クロストークに必要である、ただ、ラスたんぱく質は、カルシウムシグナリングによって活性化される。LY PTENの局在について 基本的に、PTEN is preferentially expressed in neurons and is especially evident in Purkinje neurons, olfactory mitral neurons, and large pyramidal neurons. To analyze the function of PTEN in neuronal differentiation シングルセルでは、核と細胞質中に存在することがわかっている。 1.神経細胞には、樹状突起上に約1万個のスパインがあります。人が記憶する前と後で、脳の中で何かが変わっているはずです。実際、このスパインは大きさをダイナミックに変えることから、一つ一つのスパインは記憶の最小単位だと考えられています。故に、個々のシナプスの特徴を知ることは、記憶のメカニズムを探る上でとても重要です。 2.神経細胞において、脂質シグナルは、記憶のモデルとなるシナプス可塑性と呼ばれる現象に必須であります。脂質シグナルは、シナプス前膜からグルタミン酸が放出されるとシナプス後膜のグルタミン酸受容体が活性化し、ホスファチジルイノシトール4,52リン酸、(PIP2)から(ジアシルグリセロール)DAG,ホスファチジルイノシトール3,4,53リン酸(PIP3)が産生されます。これらの脂質は、下流のたんぱく質を制御して、シナプス可塑性を引き起こします。 従来までの脂質の測定法は、破壊分析に頼っていたために、一個一個のシナプスの個性を失っていました。そこで、目的は、脂質シグナルを一つ一つのスパインで観察するということです。 3.申請者は、現在までに、蛍光共鳴移動FRETプローブ分子を開発しました。CFP, YFP, 脂質結合ドメインをαへリックスで連結します。プローブを膜局在シグナルで細胞膜に連結します。脂質が増えると脂質結合ドメインが結合し、グリシングリシンを中心にプローブが動き、CFPとYFPが近づきFRETが起きます。CFPとYFPの蛍光強度比から脂質の量を測定しました。培養細胞での脂質のそれぞれの膜での脂質の動態を明らかにしてくることによって、高い評価を得てきました。 4本研究では、直径1μmほどの微小空間での脂質の動態を調べることにチャレンジしてみようと考えております。直径1μmほどの微小空間においては、現在私の用いている蛍光強度比タイプのFRETプローブでは、YFPの光分解が激しく、蛍光強度比が一定しないという短所があります。そこで、蛍光寿命を測るためのプローブ分子に改良を行います。従来のプローブのCFPをGFPにYFPを蛍光を発しないYFPに変えます。蛍光寿命FRETプローブの特徴は、GFPの蛍光寿命で測定するために、GFPが光分解したとしても、ただ、蛍光強度がさがるだけで、蛍光寿命は変化しません。図のようにFRETが起きたときは蛍光寿命を表す直線の傾きが小さくなります。よって、微小空間でも精度の高いデータを取ることが可能となります。このFLIMを導入している研究施設は、世界でも3番目、日本ではうちが始めてです。 5.実験においては、この作製したFLIMプローブを海馬スライスに遺伝子銃によってトランスフェクションします。次に、詳細は省きますが、自作の2光子顕微鏡を用いて、神経細胞を観察します。 6.次に、プローブを発現した神経細胞の一つ一つのシナプスを刺激します。2004年に開発された、グルタミン酸アンケイジング法を用います。まず、グルタミン酸前駆体をインキュベートします。一つのシナプスの近傍に光刺激を行うと、この限られた範囲でグルタミン酸が産生され、シナプスが刺激されます。図を観察すると0分で刺激を受けた赤点のスパインが、大きくなっていることがわかります。シナプスはある一定以上の強さの入力を受けることで、このように大きさを変えます。これは、このシナプスがこの入力を記憶したということを示しています。申請先研究室では、このシステムをいち早く取り入れ、80%以上の確率でシナプスサイズを変えることが可能であります。本研究では、スパインの大きさを変えた際に脂質シグナルがどのように変化するのかを追っていきます。 7.一年目では、2光子顕微鏡のセットアップを行う。それと同時に、PIP2,DAG,PIP3のプローブ分子をFLIMプローブに変える。このプローブの特徴は、脂質結合ドメインを変えることによって、様々な脂質を見ることができることです。DAGのためにPKCC1Bドメイン、PIP3のために、GRP1のPHドメイン、PIP2のためにPLCデルタのPHドメインを結合してプローブを作製します。 2年目では、プローブ分子を発現させます。このプローブは、スパイン、樹状突起の細胞膜に局在します。グルタミン酸産生に伴い、基質であるPIP2は減少し、DAGおよびPIP3は増加すると考えられます。しかしながら、DAGは破壊分析の結果から一過性、PIP3は、持続すると期待できます。よって、空間的には、PIP3が樹状突起を移動していくのではないか?と推測します。 8.3年目は、樹状突起を進展する脂質シグナルが神経細胞の機能にどのように関わっているかを調べようと思っています。脂質シグナルは、隣接するスパインにも及ぶと考えられますから、何か、隣接するシナプスに影響を与えるのではないかと考えられシナプス間のクロストークなどを調べることがきるのではないかと考えます。例えば、近いスパインでは、遠いスパインに比べて、シナプス構造可塑性を引き起こすための、刺激の閾値が下がると期待できます。この際、樹状突起上に脂質の移動を阻害するようなたんぱく質を仕込むことで本当に脂質が関与しているかを調べようと考えております。 9.この研究において期待できること 現在、シナプスの入力へのパターンはわかっていません。クロストークが起きれば、Aいう入力やBという入力に対して、あるシナプスのクラスターができると考えられます。2007年にやっと、ラスたんぱく質のシグナリングがシナプス間のクロストークに関係することがわかるようになってきました。しかし、まだあまりにもわかっていることが少なすぎます。私の脂質の動態を明らかにすることで、脂質シグナルとシナプス間のクロストークの関係を明らかにし、記憶の基盤となる神経回路のパターンの解明を行う。 10. PIP3シグナリングは、1時間以上も続いているということ。これは、高頻度の電気刺激をおこなっってシナプス可塑性を誘導したときに、PIP3産生酵素PI3Kの阻害剤であるLY29を加えたときに、シナプス可塑性が阻害されるということからわかります。よって、脂質の速報拡散は、0.5μm・秒なので、十分に樹状突起を移動することができるということ。ラスたんぱく質のシグナルが樹状突起を介して隣のシナプスに移動し、スパインのシナプス可塑性の閾値を下げるということは報告されています。もちろん、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置しているわけですから、脂質シグナルがどのようにラスたんぱく質を制御しているかを調べることは興味深いと考えられます。 もう少し、クロストークの背景を教えてください。 NOやエンカンナビノイドなどについても含めて。 NOやエンカンナビノイドのクロストークは、NOやエンカンナビノイドが膜を超えることができて、これがシナプス前膜に作用して、隣接するシナプスへ影響を与えるというものであります。しかし、これらの研究は、専ら、電気生理学で行われており、本当に、隣接するスパインでのクロストークを見ているかについては全く、わかっておりません。 このように、シナプス前膜に作用するわけですが、シナプスのクロストークは何も前膜だけでなくて、シナプス後膜スパインで起きていてもよいわけです。近年、2008年にすぼぼだ博士が始めてRasシグナルが関与しているということを示しました。興味深いことにラスと脂質シグナルは結びついている。よって、脂質シグナルも何か関係があるのではないかと期待しております。 一つのスパインを調べることそんなに必要なの? 大事です。そもそも脳を研究する究極の目的は、脳を完全に理解することです。理解することができれば、それをターゲットとした薬も作ることができる。しかし、現在、記憶を担う記憶の回路については、ほとんどブラックボックスなのです。いきなり難しいことはできない。記憶の最小単位のシナプスがどのような回路パターンで振舞っているのかを調べることができれば、次の高次構造を調べることができる。さらに、神経細胞レベルで調べることができれば、もっと、神経同士のクロストークを調べることができます。だから、スパインでのいろいろな角度からの情報がほしいのです。だから調べることは意義があります。 クラスター化することってそんなに大事なの? これから調べるのでなんとも言えませんが、大事だと考えられます。 これは、ちょっと、大胆な仮説でありますが、例えばりんごという情報を記憶したとする。その時、周りのスパインにも影響を及ぼします。これによって、りんごに付随する情報、赤い、おいしいなどのものを近傍に入力しやすくします。すると、今度思い出すとき、神経回路にとって効率よく思い出すことができる。そのようなことを念頭に考えております。 このためには、例えば、これに脂質シグナルが関与するかを調べるためには、脂質シグナルを樹状突起上で阻害するような、マウスを作ってやって行動解析を行うことによって何か情報が得られるのではないか?もし、この実験でうまくいけば、そのようなことも可能だと考えられます。 カレルのパクリじゃないの? Rasシグナリングは、10マイクロメートル。ねいちゃーのやつも10マイクロメートル。 病気と脂質シグナルの関係は? 最近、報告された例は、2008年にアルツハイマー病に関与するAbたんぱく質を皮質一時神経細胞に加えるとPIP2の量を減らすことが報告された。これは、カルシウム依存的で、しなぷとじゃにんを発現していないラットでは、PIP2の起きないことがわかっている。よって、Abの影響は、しなぷとじゃにんを介してPIP2を減らすことで神経細胞の不全を起こしているのではないか?と考えています。ダウンシンドロームのモデルマウスでPIP2の量が減っているということも知られております。また、加齢マウスでは、PIP2の量が減っていることが知られて、PIP2の原料となる脂肪酸を加えるとPIP2が増えてさらにシナプス可塑性があがることが知られています。また、PIP3シグナルの下流のGSKたんぱく質が、加齢における記憶の再固定に関わっていることが、ノックアウトマウスを使った実験から明らかになっている。 FLIMに最低限必要なこととは? 1.80MHzのパルスレーザー 2.高感度の光電子増倍管 3.ナノ秒オーダーで蛍光寿命を取得するハードウェア 蛍光寿命についてもう少し詳しく教えてください。 蛍光体が励起光を受けると励起状態になります。ここでの滞在時間が蛍光寿命です。励起光が基の準位に戻るときには、3つの過程でもどります。発光遷移(光)、無放射遷移(熱)、蛍光共鳴エネルギー移動です。ここにあくせぷたーがあると、S1状態での蛍光体の滞在時間が短くなる。よって、蛍光寿命を表す減衰曲線が短くなります。 やることたくさんあるけれど、現実可能なのか? やるべきことの重要なポイントとしては。 1.2光子顕微鏡のセットアップ。およびグルタミン酸アンケイジングシステム。これは、MIT時代に習いましたので、単純に組み立てるだけです。 2.FLIMのセットアップ。これも、脂質プローブではありませんが、すでに、FLIMを取るためのノウハウはありますので、あとは、組み立てるだけです。 3.プローブ作りおよびその改良は、1年目で行えます。 4.一度、このようにFLIMが取れる設備が完了すれば、後は、とるだけですのでどのように研究を進めるかというアイディア勝負になると思います。ですので、多くは見えますが、1年あればセットアップはできます。 俺は、こうじゃなくてもいいんじゃない?という質問に弱い。 あと、今まで、考えたことがないようなことを聞かれると弱い。 だけど、これに関しては誰でも一緒。 次に、脂質の移動を止めるために、セプチンたんぱく質を強制発現します。発現します。このたんぱく質は、図のようにスパインネックに発現します。緑がGFPセプチン、赤は神経細胞の形状のマーカーです。セプチンは3nmほどのたんぱく質でこれらがオリゴマーを形成し、スパイン脂質の移動を阻害します。この状態で、一つのシナプスを刺激します。すると脂質の移動は阻害されますから、隣接するスパインの大きさの変わり方は、遠くのシナプスと変わらないのではないかと推測できます。 この実験によって、脂質シグナルがシナプスのクロストークに必要であるかを検証します。 ジーンがんの効率 これは、ばいおらっどとも話したのですが、まず、金粒子が入る確率および発現効率とも調べてないからわかっていないようです。そして、金が入ることによって、死んでしまう細胞も中にはあるかもしれないです。うまい具合に入ったものだけが光る。選択性は多少あります。しかし、この理由はわかりません。入った細胞だけが変なんじゃないの?その可能性は100%否定できるわけではありません。しかし、2つあって、一つは、われわれの用いているシナプス構造可塑性に関しては、問題がないこと。また、他の研究者もこれ以外に遺伝子を導入する方法はなく、これを使っていること。入った細胞だけ大きさが変わっているんじゃないの?実はというと、電顕でアンケイジングしたスパインを見たものがあります。やはり変わっていました。 それって、MITでやったことでしょ?そういうの出しちゃだめだよ。 2光子顕微鏡のメリットは?共焦点との違いは? 励起光が違う。 中まで到達することができる。紫外光による細胞ダメージはない。 ただ、スライスの表面などでは、共焦点でも細胞体は見ることが可能である。 ただ、ゆくゆくはねずみの頭などで行うには、共焦点では明らかに見えません。この理由は赤外光だから 2光子顕微鏡の分解能は、共焦点と同じくらいで200-300 nmくらい? しかし、z軸分解能はとても悪くなる。 また、実際には、うちのシステムは、共焦点ではできません。というのは、あんけいじんぐは、光分解を一点で行う必要があります。共焦点では、できない。 脂質とプローブの関係はどうなっているのか? 普通培養細胞は、1plくらいだと考えられています。 スパインの中は0.1flから0.01flくらい 大体、100倍くらいだと考えられます。 大体、DAGは、1fモルです。一細胞に。 だから、10あぷとモルくらいある。 PIP3の場合は、その100倍くらい少ないから。100ゼプト盛るくらいあります。これが、刺激によって10倍くらいに変わるといわれています。 脂質プローブと脂質の結合能は、かなり高いですから、始めから結合していると考えられます。ここで、刺激が加わると、破壊分析の結果などを参考にしますと10倍から最大で50倍くらいの脂質ができます。これに、プローブが反応して応答するということになります。これは、プローブ全部を応答させるための量く らいできます。 FLIMについてもう少し教えて? FLIMのメリットは?他にないの? 蛍光強度比フレットだと、YFPのスペクトルが漏れて、YFPも励起してしまう。あと、YFPの蛍光のCFPへの漏れこみも問題になってくる。 しかし、FLIMでは、YFPが消えているので問題ない。 現在は、場所をきちんと記憶できるようなステージがあるので、これを用いてシナプスの場所を特定して、アンケイジングを行って免疫染色を行うというのは不可能なのか? 答え。ポイントは、リアルタイムでとることができないということになるでしょう。2番目には、刺激前と後で比較を行うことができないということです。 あなたのプローブ本当にそのように働いているの? 例えば、グリシングリシンを除くとうまく働かなくなる。また、脂質局在ドメインを除いた細胞質プローブではうまくいかないなどの点から、確かに、このプローブのポイントとなるところがきちんと働いて脂質を検出していると考えられます。 現在、FLIMを行っている人の研究者はどれくらいいるの? 神経細胞ということで、FLIMの論文を出しているというところになると、3人ほど思い出します。一人目はハーバードのMGHで、アルツハイマー病のマウスやラットにおいて、カルシウムシグナルがどのように変化しているかを調べているぶらいあんばくすかい博士。しかし、この研究はシナプスではなく主に細胞体で調べております。次に、スパインレベルであると、かなり少なくて、かれるすぽぽだと、やすだりょうへい博士です。やすだ博士はかれるのぽすどくでした。近年、MIT時に林研で作製したCaMkIIプローブをFLIMに改良してCaMkIIの活性を調べて高い評価を受けたことは記憶に新しいです。 脂質の動態ということになると、培養細胞レベルでは、京都の松田先生が、私たちのプローブを用いて脂質の動態を観察しております。斉藤尚明先生がPKCの活性化を調べております。 Roバリューはどれくらい。50から60Åくらい。 2光子と共焦点の違い 実際、共焦点でもスライスくらいだったら神経細胞体のカルシウムイメージングなどは可能である。 今まで、細胞質タイプのプローブで見られていると思うけれどあれじゃだめなの? はい、まず大前提にあるのは、細胞質タイプのプローブで調べられているのは、神経細胞全体を刺激しているということ。そうすると、全体が刺激されるので、プローブの局在をみることができます。しかしながら、一点でグルタミン酸刺激を行うと、細胞質タイプでは見ることができません。何故かと言うとポイントは、バックグラウンドです。 どのくらいの長さイメージングするの?シナプス構造可塑性の実験では、大体一時間くらい。ですので、一時間くらい観察しようと考えております。 プローブの局在はどうなるの?私のプローブ分子には、N-rasの脂質修飾ドメインがついております。スパインおよび樹状突起です。 メカニズムは?ファルネシル基で小胞体に結合し、パルミトイル基で細胞膜に結合します。 昔の研究のぽいんとは? 私のプローブ分子の特徴は、2点あります。 それによって、図で示す。 透明YFPの原理? 蛍光は、蛍光体が高い順位から低い順位に移るときに起きます。 その際に、発光遷移のほかに、2つ影響を受けるものがあります。 一つは、無放射遷移、これは、熱によるもの。 2つめは、蛍光共鳴エネルギー移動。 透明なYFPの場合は、この無放射遷移で起きています。 この研究で困難だと思われるところはどこでしょうか? カルシウムシグナリングとの関係は? カルシウムによって、CaMKIIなどが活性化しシナプス可塑性を誘導します。阻害剤を加えた実験から、カルシウムシグナリングも脂質シグナルもどちらも、シナプス可塑性に重要であることがわかっています。しかしながら、カルシウムシグナリングは、スパインで留まることが知られています。よって、シナプスのクロストークはむしろ代謝型グルタミン酸受容体が関与しているのではないかと考えております。しかしながら、グルタミン酸受容体の下流の脂質シグナルは、カルシウムシグナリングに比べてほとんどわかっておりません。よって、調べるために意義のあることだと考えます。 岡本さんのFRETの図と安田さんの図 これすべて、すでにできているんじゃない? 簡単にできるんじゃないの? 確かに、2光子顕微鏡のセットアップ、アンケイジングシステムのセットアップ、FLIMの測定のノウハウは知っていますが、実際組み立てるのはかなり時間がかかります。あっという間に1年かかります。逆に言うとそれくらいじゃないと3年間では終わりません。 他に、どんなFRETプローブを作ったら面白いの? FLIMは本当に高感度か? シナプス可塑性ってどうやって測るの? MIT時代には何をやってきたのですか? 大きく分けて3つあります。2行使顕微鏡のセットアップのノウハウ。アンケイジング法のノウハウ。FLIMの測定のノウハウ。実際、私、昔脂質の研究を行っていまして、脳という新しい分野に挑戦するに当たって、脳のことほとんど知らなかったので、しかも、初めての海外ということで言葉は通じないし、林先生に朝から晩まで働かされるし、本当に大変でした。 FLIMとかだしちゃっておかしくない?書いてないよ? 2点ありまして、1点目は、申請書に書ききれなかったということ。 2点目は、私は、常に面白いアイディアを考えております。よって、面白いものがあれば、どんどんアップデートをしていきます。 何か、脂質シグナルがシナプスのクロストークに関係しているという証拠はあるの? 確定的な証拠はありません。間接的な証拠としましては、PIP3シグナリングは、1時間以上も続いているということ。これは、高頻度の電気刺激をおこなっってシナプス可塑性を誘導したときに、PIP3産生酵素PI3Kの阻害剤であるLY29を加えたときに、シナプス可塑性が阻害されるということからわかります。よって、脂質の速報拡散は、0.5μm・秒なので、十分に樹状突起を移動することができるということ。ラスたんぱく質のシグナルが樹状突起を介して隣のシナプスに移動し、スパインのシナプス可塑性の閾値を下げるということは報告されています。もちろん、脂質シグナルは、ラスたんぱく質の上流に位置しているわけですから、脂質シグナルがどのようにラスたんぱく質を制御しているかを調べることは興味深いと考えられます。 では、他に何か面白いテーマはないの? 確かに、PIP2は、シナプス前膜で調べられているので、ベシクル小胞が放出する際に、このプローブをシナプス前膜に導入しておいてどのような時に産生しているのかということを調べることは重要です。それよりも、私が興味を持っているところは、シナプス構造可塑性、つまり、シナプスが大きくなるときに、劇的に脂質の量が増えているわけです。短期間でのこの脂質の増加は、ちょっと信じられません。例えば、細胞分裂は5時間ほどをかけて1つが2つになるわけですが、この可塑性に関しては、1分以内に2倍以上になるわけです。この時、とんでもなく脂質代謝が動いていると想像できます。そのパスは2つあって、1つは、細胞膜で激しく脂質産生酵素が動いていること。もう一つは、トランスゴルジなどから激しく膜輸送が起きること。どちらかを調べることはとても面白いと考えております。 私は、常に、よくなるように考えております。ですので実験がよいと思えば変えます。本筋は外れておりません。 従来までのグルタミン酸を放出する方法。 バスアプリケーション。マイクロパフ。電気刺激 刺激はどのようにやっているの? 0.5Hz.2ms、1Hzなど。とにかく電気生理でシナプス可塑性が起きていれば大丈夫。 クロストークをとめたら連想がとまった。 脂質シグナルをとめたら連想することができなくなった。 How much does enlargement of spine happen? How much does lipid second messenger is there? Is it right to tell lipid signaling as controller of signal? What is the function of septin? Septin is discovered in1971 in budding yeast mutants defective in cell-cycle progression. If you overexpress the septin, not only lipids but also the protein, which localize in membrane, is stopped by the septin, right? I need to prepare the septin, which have mutant ATP binding site or mutant enzyme activity delation mutant. You should learn the mechanism the pathway until producing lipid second messenger. ラフトによって、もっと上流のたんぱく質は動くことがないのではないか? Gたんぱく質はそるブルだから大丈夫。しかし、Gbrは膜局在型。代謝型グルタミン酸受容体はどのGたんぱく質を活性化するのか?また、PLCデルタ、PLCβは泳ぐが大丈夫か? ラフトとPIP3の関係は? 確かに、ラフトみたいなところでできますが、物理的な面から言うと、ラフトは、比較的飽和脂肪酸を足に持った脂質がいるところです。PIP3,DAGの足は、ステロイルアラキドノイルなので、ラフトをでることはあながちおかしくないと考えられます。 脂質の組成がミックスしないようにたんぱく質がバリアを作っているということは結構ある。らてらるとばそらてらる。 でんどらいとにのみ発現しているようなたんぱく質はないだろうか? What size is lipid? ゴーシュ型でC-C 1.513; C-H 1.112 Å アンチ型でC-C 1.511C-H 1.112 Å 大体DAGは5Å, 10Å PIP3は10Å, 10Å PTEN, DGKをノックアウトしたらどのくらいまで伸びるのか? 本当に脂質はシグナルの司令塔なの? 西塚先生を出す。 デイビッドホロビンを出す。 脂質って細胞膜からどれくらい出ているのか?PIP3だったら15nm以上は出ていると思う。 もし、始めから脂質の移動が阻害されていたらどうする? 確かに、CaMkIIはスパインでのみ活性化されることが知られている。 しかし、Rasは結構長く伸びることが知られている。 脂質の移動を阻害するものの有力なものとして、セプチンがあげられるのですが、エンドジーニアスなセプチンもあります。ただ、結構、すべてのスパインネックに存在しているわけではなく、もしかしたら、脂質の移動を変えるような働きをしている可能性があります。クロストークに選択性があるということでとても面白いということになります。 脂質シグナルをスパインで見ることの重要性。 2光子顕微鏡のメリットとは? 共焦点でも、スライスでも見えるんじゃないの? 別に、2光子顕微鏡で見なくてもいいんじゃないの? 何故あなたは脂質シグナリングを選んだのか? 1.脂質シグナルは移動することができるシグナルの最上流である。 2.脂質シグナルの特にPIP3シグナリングはしばらくの間持続する。 PKCの局在を見てみるとデンドライトでも起きている。やっぱり脂質は移動していると考えられる。 実は、かれるによって、らすシグナルが閾値の上昇に必要だということがわかっている。しかしながら、何故ラスなのか?実は、ラスはPIP3の下流なんですよね。 PTENの局在。 DGKの局在。DGKはカルシウムによって活性化されるが、神経細胞でのカルシウムの上昇は瞬時である。 これによって、あるシグナルに反応しやすくなるようになり、ある反応に応答するシナプスクラスターができるのではないだろうか。 シナプスのクロストークに脂質シグナリングが関係していなかったら? 脂質修飾のメカニズムについて。 PIP2の局在は?下の論文にあるように恐らく均一に存在する。 しかし、結局のところ活性化されたグルタミン酸受容体がどこにあるかが重要でさらに、活性化したPI3KとPLCがどこにあるかによる。 Neuroscience Letters 423 (2007) 158–161 もしかするとPLCやPI3Kがデンドライトまで泳いでいって、PIP2を代謝することはないのか? 恐らくないと思う。その根拠は、代謝型グルタミン酸によって活性化されるPI3Kはp110rだと考えられます。 このたんぱく質は、脂質修飾を受けているたんぱく質とコンプレックスを作っている。 もしかしたら他の脂質修飾されていないようなたんぱく質がPIP3を作る可能性があるかもしれないよ。 そしたら、それは、わかりません。ただ、ここで重要なのは、PIP3ができて、それが樹状突起を移っていくことが観察できればいいのだと考えております。 PI3kは1,2,3型が存在する。そのうちPIP2を基質とするものは、I型だけである。一般的なI型のA型は、チロシンリン酸型受容体によって、活性化される。一方、I型のB型は、p110γであり、これは、Gたんぱく質共役型受容体によって活性化される。Brとアダプターたんぱく質のp101と複合体を形成する。このため、かなり移動度が遅いと考えられる。よって、PIP3のような低分子の方がかなり早く動けるのではないかと考えております。 よって、PIP3の量は、PTENとPI3Kのバランスで決まっている。しかし、 PIP3を作り出す刺激は、グルタミン酸受容体だけなの? いえ、恐らく他にもあるとかんがえられます。しかしながら、今回絞っているのはグルタミン酸受容体だけです。 DGKはどこにいるの?細胞質中にいますが、DGKは、9つのアイソフォームがあって、α、βは、PSD結合ドメインを持っていないが、γ、ζはもっている。基本的に、デンドライトシナプスにいるが、後者は、PSDに濃縮されている可能性もある。 別にあなたのプローブじゃなくてもサイトゾルプローブで赤と緑比較してできるんじゃないの? 実は、それでは難しいです。というのは、仮に、フレットプローブと膜局在プローブが培養細胞などで100%応答した場合どちらも、最高の状態となります。しかし、神経細胞においては、デンドライトと繋がっていますから、さらに、プローブが入ってしまうわけです。すると、膜局在方はこの赤と緑がバックグランドとなって、感度が小さくなってしまうということがあげられます。よって、FRETプローブの方が応答はよいであろうと考えら得ます。 mGluRによって活性化されるPI3Kとして、IB型が挙げられる。これは、Gbrによって活性化される。 ちなみに、NMDA依存的にPIP2が減少する系も存在する。これには、2つの可能性が挙げられる。PLCが泳いでいった。もしくは、樹上突起にも受容体が多少なりとも存在し、それが活性化した。しかし、今調べたいのは、スパインから産生された脂質分子であるから系が全く違うと考えられる。 PIP3は、様々な方法で産生されると考えられる。スパインにはチロシンキナーゼ受容体EPH受容体なども存在するだろう。だから、PIP3が産生されるメカニズムはたくさんあると考えられる。しかしながら、今回はグルタミン酸受容体を考えているからそれによって活性化されるのは、代謝型グルタミン酸受容体だと考えられる。 もしかすると、brが移動するかもしれない。しかしながら、脂質とGたんぱく質どっちが移動が早いかというと、grの方が大きいから移動しづらいと考えられる。 Rasの活性化は、11microm//4 minである。とても遅い。結局、上流のシグナルがどうなっているかについての情報は何も与えないことになる。 クロストークを行うと何がいいのか? スパインネックが見えないんだけれどどういうこと?本当にくっついているの? 何分後に刺激をするの? どんな点が困難だと考えられるのか? 逆に、スパインで制限されたらどうするの? 答。もちろん計画を立てるときには一番面白い作業仮説をたてるわけであります。それはそれで面白いと考えられる。その一つとしてセプチンが上げられます。 普段から脂質はセプチンによって抑えられているんじゃないの? セプチンは、細胞質のたんぱく質の拡散も防ぐんじゃないの? それは、GFPを発現させてホトブリーチすればよい。 それを調べるためには、セプチンRFPを発現させて本当にセプチンが阻害するかを調べればよい。 スパインの大きさってどれくらい? シナプスのクロストークにプラスマイナスはあるのか? タイトルはゴシックにする。 申請者の利点はちょっと変えるべき。 何故FRETを使うか?理由を述べる、 脂質シグナルをわからせる 10出たものが拡散してしまうと3になってしまう。それでよいのか? セプチンの情報 あるセプチンは、PIP2などとくっついて膜のbracingを起こす。Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Tanaka-Takiguchi Y, Kinoshita M, Takiguchi K. Curr Biol. 2009 Jan 27;19(2) 140-5. DiIは分裂溝を通る。 ただ、Dilは細胞膜の表面に入ることから表側である可能性が高い。 細胞膜の成分をミックスしないで、そのまま分けるという役割を持っているたんぱく質の一つにセプチンというたんぱく質があります。セプチンは、主に細胞分裂の際に分裂溝にセプチンリングを形成し、細胞分裂に必要なたんぱく質です。また、細胞膜上の成分をミックスしないようにしているからです。 ですので、 スパインのコンパートメントについて カルシウムは、シナプスで制限される。 CaMKIIも同様に制限される。 しかしながら、Rasたんぱく質は制限されずに、クロストークに必要である、ただ、ラスたんぱく質は、カルシウムシグナリングによって活性化される。LY PTENの局在について 基本的に、PTEN is preferentially expressed in neurons and is especially evident in Purkinje neurons, olfactory mitral neurons, and large pyramidal neurons. To analyze the function of PTEN in neuronal differentiation シングルセルでは、核と細胞質中に存在することがわかっている。 一人目の先生が、免疫染色でPIP3の進展は確認されているの?という質問をしてきた。俺は、前に佐々木とそのことについて話していたにも関わらず、うまく説明することができなかった。結局、リアルタイムで取れることが大事だという風に言ってしまったが、そうじゃない。本当の答えは、シナプス構造可塑性を起こしたスパインを、一度視野からはずして、免疫染色して見るというのは極めて不可能に近いということである。そのように答えないと正解とはいえない。今考えてみると、ちょっと、彼も不思議そうな顔をしていた。
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モンスター/スライム v2.0.0 ショゴス/Shoggoth (L.Dark j; ) === Num 685 Lev 48 Rar 2 Spd +30 Hp 800 Ac 80 Exp 2500 「古のもの」によって創造された、黒くネバネバした巨大な多細胞の原形質。不定形であり、いかなる器官も自由に作り出すことができる。 「テケリ・リ」という独特の鳴き声をあげる。水陸両棲の、無愛想で不機嫌な召し使い。 もともと知性は低かったが、次第に主人である「古のもの」を模倣するようになり、反抗して滅ぼした。 「悪臭放つ虹色に輝く悪夢じみた可塑性のある柱が... 原形質の泡の無定形の塊が、自らかすかに輝き、わたくしたちに向かいあう、 トンネルを満たす前部のいたることろに、緑がかった光を放つ疣のような何万もの一時的な眼を構成したり消したりしながら、 あわてふためくペンギンたちを押しつぶし、同類とともに邪悪にもすべてをとりさったなめらかな床をずるずるすべってきたのだった。 なおも不気味な嘲笑うような声「テケリ・リ!テケリ・リ!」が聞こえ...」 (H・P・ラヴクラフト、大瀧啓裕訳「恐怖の山脈にて」『ラヴクラフト全集4』、創元推理文庫、pp.300-301) それは通常地下 48 階で出現し、信じ難いほど素早く動いている。 この混沌の勢力に属する悪魔を倒すことは 1 レベルのキャラクタにとって 約40000.00 ポイントの経験となる。 それは巨大で力強く狂気を誘う悍ましい姿だ。 それはドアを打ち破り、弱いモンスターを倒し、アイテムを壊すことができる。 それは素早く体力を回復する。 それには明るい光や破邪でダメージを与えられる。 それは酸と稲妻と炎と冷気と毒と暗黒とテレポートの耐性を持っている。 それは進化しない。 それは恐怖を感じないし、混乱しないし、眠らされない。 それは侵入者をしばらくは見ており、 1000 フィート先から侵入者に気付くことがある。 それは 5d6 のダメージで体当たりして酸を飛ばし、 5d6 のダメージで体当たりして酸を飛ばし、 5d6 のダメージで体当たりして酸を飛ばし、 9d9 のダメージで体当たりして攻撃する。 雑感 名前
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1:一語発話 2:一般的出来事表象 3:意味論、意味の発達 4:韻律知覚 5:絵本場面での話しかけ 6:音韻意識 7:音韻知覚 8:会話の能力 9:過拡張的使用 10:語り(ナラティブ) 11:緘黙 12:規準喃語 13:吃音 14:共同注意 15:言語獲得支援システム(LASS) 16:言語獲得装置(LAD) 17:言語獲得理論 18:言語障害学級 19:言語聴覚士(ST) 20:言語と認知の交互作用説 21:言語の局在論・脳の可塑性 22:言語の先駆的行動 23:言語発達と脳構造 24:言語発達の社会的・文化的側面 25:言語発達の生物学的・神経学的基礎 26:言語領野(ブローカ領野・ヴェルニッケ領野) 27:語彙獲得の制約 28:語彙の爆発期 29:構音の誤り・構音障害 30:構音発達 31:語義語用障害 32:国語教育と他国語教育 33:ことばの遅れ(言語発達遅滞) 34:ことばのテスト絵本 35:語用論、語用論的アプローチ 36:三項関係 37:CDS(子どもに向けられた発話、matherese、育児語) 38:失語症(ブローカ失語、ヴェルニッケ失語) 39:ジャーゴン 40:社会的交互作用説 41:社会的参照 42:条件詮索反応聴力検査(COR) 43:象徴機能 44:書字表出障害(Dysgraphia) 45:スクリプト 46:前言語期 47:第二言語習得の最適期 48:多語文での助詞の役割理解 49:談話(ディスコース)の能力 50:聴覚障害 51:聴性脳幹反応検査(ABR) 52:伝統的治療観と現代的支援観(言語発達支援における) 53:電報体発話 54:道具的コミュニケーション 55:特異的言語発達遅滞(SLI) 56:読字障害(Dyslexia) 57:喃語 58:難聴(感音性難聴、伝音性難聴) 59:二語文・二語発話 60:乳幼児のテレビ視聴 61:脳の側性化 62:バイリンガル 63:初語・始語 64:反響言語(エコラリア) 65:表出語彙と理解語彙 66:フォーマット 67:普遍文法 68:プレリテラシー 69:文形成期 70:文法発達 71:平均発話長(MLU) 72:保育場面での支援 73:補助代替コミュニケーション(AAC) 74:メタ言語 75:やりとり遊び 76:有意味語 77:指差し 78:読み書き能力(リテラシー) 79:読み熟達過程 80:ラテラリティ(laterality) 81:ろう文化と手話 82:話題や意図の共有
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第3章 有機物が土壌を作る1. 土壌を完成させるもの 2. 土壌有機物は炭素循環で決まる1) 地球規模の炭素循環と土壌有機物 2) 耕地規模での炭素循環 3) 土壌水分環境、気温の違いと土壌有機物の蓄積量 3. 土壌有機物、腐植、腐植物質―その意味の違い1) 土壌有機物 2) 非腐植物質 3) 腐植物質 4. 土壌有機物の働き1) 植物への養分供給源 2) 養分の保持と土壌の緩衝力を大きくする作用 3) 養分の有効性や有害物の調整 4) 植物の生育促進 5) 団粒形成と土壌構造安定化 6) 土壌への吸熱効果及び土壌の保温効果 7) 土壌微生物への栄養源 第4章 「土は生きている」―土壌生物の働き1. 土は生き物か? 2. 土壌と有機物をつなぐ土壌生物 3. 土壌に生息する生物の種類と数1) 土壌動物 2) 土壌微生物 3) 土壌動物と土壌微生物の関係 4. 土壌動物の働き1) 粗大有機物の破砕 2) 有機物の土壌中への引きずり込み 3) ミミズによる土壌改良効果 5. 土壌微生物の働き1) 有機物の無機化 2) 土壌酵素による有機物の分解と無機化 3) 有害有機物の分解と浄化 4) 植物との共生関係 5) エンドファイト 第5章 土壌の骨格とそれを決めるもの1. 土壌の三相―固相・液相・気相 2. 土壌の容積重 3. 三相分布と土壌の重量 4. 土壌有機物と三相分布 5. 土壌粒子の大きさと液相 6. 土壌の可塑性・粘着性 7. 土壌粒子の大きさと特性1) 土壌と土性 2) 粒径区分と反応特性 8. 土性による土壌分類 9. 土壌の性質を支配する粘土の働き1) 粘土と比表面積 2) 粒子相互の調和 10. 粘土と粘土鉱物 11. 粘土鉱物の種類1) 層状ケイ酸塩粘土鉱物 2) 明確な結晶構造をもたない粘土鉱物 3) 鉄、アルミニウムの酸化物・水和酸化物 12. 粘土鉱物の生成と元素の稼働率1) 粘土鉱物の生成と環境 第3章 有機物が土壌を作る 1. 土壌を完成させるもの 土壌の原材料→地殻表層の岩石 岩石→(風化+有機物)→土壌 有機物がポイント! 2. 土壌有機物は炭素循環で決まる 土壌が完成したら有機物は? 「炭素循環」がキー 有機物は炭素を含む化合物の総称=炭素量は有機物量 有機物を作る重要な存在は?→植物 植物の生育に有機物の添加量、分解量が左右される 植物の生育は?→気象、環境に左右される 土壌の有機物量はその場所の気象、環境条件の下での平衡値へ向かう。 1) 地球規模の炭素循環と土壌有機物 深さ1mの土壌中に現存する炭素量(推定) = 2,400Pg(2,400 * 10^15g) 全植物 550Pg 大気中 750Pg 大気から植物へ吸収される炭素 110Pg/year …等々 合計すると、人為的な炭素放出等が原因で大気中炭素量は4.5Pg/yearの速度で増加していることになる。 2) 耕地規模での炭素循環 (家畜飼料用トウモロコシ圃場の例) 3) 土壌水分環境、気温の違いと土壌有機物の蓄積量 植物の有機物生産速度 25℃くらいで極大 微生物の有機物分解速度 35℃くらいで極大 →有機物が分解されていくか蓄積されていくかは概ね温度で決定される 好気的条件の方が微生物の活動は活発。嫌気的では抑制気味。 →畑より水田の方が有機物が蓄積されやすい 3. 土壌有機物、腐植、腐植物質―その意味の違い 1) 土壌有機物 土壌中の有機物 生物(動植物、微生物) 易分解性有機物(動植物の遺体など) 難分解性有機物(微生物の分解を受けた有機物など) 非生物由来有機物(非生物有機物の方が適切な表現?)のうち、同定可能、除去できる動植物遺体以外のものを土壌有機物と呼ぶ。 土壌有機物と腐植は同義。 腐植は非腐植物質と腐植物質に細分される(ただし境界は便宜的で明確ではない)。 2) 非腐植物質 土壌有機物分解過程で生産される有機成分のうち、構造が明確な既知の物質のこと。 炭水化物(多糖類)、タンパク質、アミノ酸、脂質、リグニン...etc. 分解の難易にはバリエーションがあるが、最終的には無機物まで分解される。 土壌中の存在量は少ない。 3) 腐植物質 土壌有機物の分解産物から化学的、生物学的に合成されたもの。微生物が利用・分解した後の残りカスみたいなもの。 土壌有機物の大部分は腐植物質が占める。 非結晶、黒色の高分子有機物の混合物。 腐植物質は酸・アルカリへの溶解性によりさらに細分される。 腐植酸(フミン酸) 弱アルカリで溶けるが酸に解けない。暗褐色の高分子有機物混合物。分子量は300,000程度まで。 フルボ酸 弱アルカリにも酸にも溶ける。黄色から褐色の高分子有機物混合物。分子量はやや小さく2,000から5000程度。 ヒューミン アルカリや酸に不溶。土壌無機成分との結合がきわめて強い。 腐植酸が腐植物質としての性質がもっとも強く、以下の性質が強い。 養分の保持能力 pH変化への緩衝力 腐植物質の大部分は単体で存在している訳ではない。 粘土鉱物、鉄、アルミニウム、金属イオンなどと結合した有機無機複合体として存在している。 4. 土壌有機物の働き 1) 植物への養分供給源 土壌有機物は無機化によりN, P, Kなど無機イオンを放出する。 無機化されてはじめて有機物は植物の養分となる。 2) 養分の保持と土壌の緩衝力を大きくする作用 腐植物質の表面にはpHに依存して電荷の正負が変わる官能基が多く付いている。 これが養分(陽イオン、陰イオン)保持やpH変動への緩衝力を高める作用をしている。 3) 養分の有効性や有害物の調整 腐植物質はアルミニウムと結合しやすい アルミニウムの害減 リンとアルミニウムの結合を減らしリンの肥効UP 有害金属類とも結合しやすく汚染防止に貢献。 4) 植物の生育促進 腐植酸やフルボ酸は植物の発芽、発根、生育促進効果を持つ。 以下の表はChen and Aviad(1990)による * 腐植物質の種類 * 生育への影響 * 濃度(mg/l) 腐植酸 水分吸収の増強、発芽の促進 1-100 腐植酸・フルボ酸 発根の刺激・根の伸長促進 50-300 腐植酸 根細胞の拡大促進 5-25 腐植酸・フルボ酸 生育全般の促進 50-300 これは 溶解度の低い養分元素が有機物と結合して吸収されやすくなる 腐植物質が直接吸収されて植物ホルモン様の作用をする などの理由によると考えられている。 5) 団粒形成と土壌構造安定化 土壌粒子同士の接着剤として働くため団粒構造ができやすくなる。 6) 土壌への吸熱効果及び土壌の保温効果 黒色により太陽エネルギー吸収効率が上がる。 ただし水分保持量も多くなるので比熱が大きくなりやすく、寒冷地の春先などは温度上昇が緩慢となる。 7) 土壌微生物への栄養源 土壌有機物の複雑さは多様な微生物の栄養要求性を満たすことができるため、微生物の多様性維持に貢献する。 養分供給の面からのみならず、病原菌蔓延防止のためにも重要。 第4章 「土は生きている」―土壌生物の働き 1. 土は生き物か? 土は当然生き物ではないが、「緩衝力」を持っているという点で生物的ではある。 2. 土壌と有機物をつなぐ土壌生物 土壌の生態系 生産者 植物 消費者 動物 分解者(還元者) 土壌生物 分解者が有機物を分解し生産者が利用可能な無機物にする。土壌生物が土壌と有機物をつないでいる。 3. 土壌に生息する生物の種類と数 1) 土壌動物 土壌動物の分類 *グループ *サイズ 例 小型土壌動物 - 0.2mm アメーバ、鞭毛虫etc. 中型土壌動物 0.2 - 2mm トビムシ、ダニetc. 大型土壌動物 0.2mm - 2cm アリ、クモetc. 巨形土壌動物 2.0cm - モグラ、ミミズetc. 生息数としては中型土壌動物がもっとも多い。 巨形土壌動物としてはミミズの数が1m^2当たり数十〜数千とかなり多い。 2) 土壌微生物 土壌微生物の分類 *グループ *数(m^2当たり) バイオマス(g/m^2) 細菌 10^13-10^14 40-500 放線菌 10^12-10^13 40-500 糸状菌 10^10-10-11 100-1500 藻類 10^9-10^10 1-50 細菌や放線菌に比べると糸状菌の個体数は1/10〜1/10000と少ないが、バイオマスとしては糸状菌が圧倒的に多い。 糸状菌は植物病害に占める割合も高い(一方、動物の病気として重要なのはウイルスや細菌)。 土壌1m^2当たりの微生物の生体重を合計すると700g程度。 微生物700g当たりの炭素量は70g、窒素量は11g程度。 畑に施肥するときの窒素量は10g/m^2程度。 10g/m^2 = 10kg/10a 10%Nの肥料ならば5袋(1袋20kg)程度(やや少ない?) 土壌微生物の種類 細菌 バクテリア。細胞壁を持つが細胞核を欠く。 胞子を作り、悪条件環境を耐えるものもある。 放線菌 細菌と糸状菌の中間的な性質を持つが、細胞核を持たず細胞壁成分が細菌に近いので細菌の一種として扱われる。 菌糸を持つが糸状菌より細い。 抗生物質を産生するものもある(Streptmyces) 糸状菌 細胞核やミトコンドリアを持つ真核生物 菌糸は放線菌より太い 担子菌類と呼ばれるグループの多くは菌糸がまとまって子実体(いわゆるキノコ)を作る セルロースやリグニンなど分解しにくい高分子物質の分解能力が高い 藻類 サイズは肉眼で見えないものから数mまで様々 原核生物でもあるラン藻はクロロフィルを持ち、空中窒素の固定能力を有するものもある 緑藻や珪藻などは真核生物であり、光合成により二酸化炭素を固定する 光合成能力を持つ微生物を光合成微生物と呼ぶ 3) 土壌動物と土壌微生物の関係 土壌動物が粉砕した有機物を土壌微生物が分解する等々、両者は密接に連携している。 4. 土壌動物の働き 摂食、粉砕 植物遺体を食べる、砕く 混合 動植物遺体の土中への引きずり込み 1) 粗大有機物の破砕 土壌動物の摂食により粗大有機物は破砕される。 ミミズ 2mm以下 トビムシ 30-50 × 10^-6m ダニ 10 × 10^-6m 破砕により細菌や糸状菌による分解が促進される。 2) 有機物の土壌中への引きずり込み ミミズは土と一緒に有機物を取り込み、混合物として地表に排出する(糞塚の形成)。 糞として地表に排出される土の量は日本では3.8kg/m^2/yearに達し、厚さとしては3.1mmとなる。 ミミズ研究者の一人としてダーウィンを記憶しておくとよい。「ミミズと土」は名書。 3) ミミズによる土壌改良効果 ミミズの糞の特徴 土壌粒子が細かく、粘土やシルト分が多い 容積重はやや小さく、孔隙が多い くずれにくく、構造が安定している 養分含量が増えている ただし3.1mm/year程度の量では耕作上有効とまでは言えない。 活用したい場合はミミズの糞を資材とした「ミミズ博士」等の利用を検討するのがよいかも知れない。 5. 土壌微生物の働き 1) 有機物の無機化 土壌動物により土中に引きずり込まれた有機物は微生物の働きで無機物へ分解される(無機化)。 C CO_2 N NH_4^+ P PO_3^2- S SO_4^2- など、各種元素は無機イオンの形で土壌中へ放出される。 2) 土壌酵素による有機物の分解と無機化 有機物は土壌中に存在する酵素(土壌酵素)による分解も受ける。 土壌酵素は微生物により生産された後、体外へ放出されたもので、菌体外酵素と呼ばれる。 菌体外酵素は基質が十分存在するときのみ生産・活動する(誘導酵素)。 これらの酵素にはセルラーゼ、プロテアーゼ、フォスファターゼなどが含まれる。 3) 有害有機物の分解と浄化 土壌微生物の有機物分解能力は幅広いスペクトルを持つ。有機塩素化合物を分解するものもある。 直接有害有機物を分解する酵素を産生する場合もあるが、基質特異性の低い酵素がたまたま分解する場合もある(コメタボリズム)。 この分解能力を利用し土壌汚染を回復しようという試みもある(バイオレメディエーション)。 4) 植物との共生関係 共生的窒素固定院 根粒菌 根粒の中で根粒菌は炭素化合物としてエネルギーを植物から受け取り、空中窒素をアンモニアとして固定する。そしてアンモニアを植物が利用する。草地においてマメ科牧草が十分に存在するならば、窒素施与量を減らすことができる。 フランキアは放線菌の一種で、樹木に根粒を形成し窒素固定を行う。ハンノキやモクマオウはフランキアが共生するので「肥料木」として利用される。 ラン藻の一種アナベナはシダ植物のアゾラに共生し窒素固定をする。水田で窒素固定を行うため農業での利用もあり、有機栽培などで関心が高いが、特定外来生物に指定されている種類もあるので利用には注意を要する。 菌根菌 植物根の表面、内部に糸状菌が共生・半寄生している状態を菌根(micorrhiza)といい、菌根を形成する菌を菌根菌という。 菌根菌はリンの吸収を促進し、亜鉛、銅、カルシウムなどの吸収も条件により促進する。 外生菌根菌は植物根の表面を菌糸で覆う。マツタケやホンシメジなどの担子菌はこの一種。 内政菌根菌は菌糸が根の内部まで侵入する。とくに、細胞内部まで侵入して樹枝状体(arbuscule)を形成するものをアーバスキュラー菌根菌またはVA菌根菌と呼ぶ。 5) エンドファイト 植物体内で生涯の大半を過ごす細菌、糸状菌をエンドファイトと呼ぶ。病原菌ではないので病徴が現れるわけではないが、産生する物質が中毒症状を呈することで家畜への害になったり、害虫への抵抗となったりする。培養が困難であるため現状ではその詳細は明らかとなっていない。 第5章 土壌の骨格とそれを決めるもの 1. 土壌の三相―固相・液相・気相 固相 土壌の固体部分(土壌粒子や粗大有機物) 液相 土壌の液体部分(溶けている養分を含む) 気相 土壌中のガスを含む大きな空隙 土壌の全孔隙は液相と気相を合わせたもの。 2. 土壌の容積重 単位容積当たりの土壌の質量は条件により様々。例えば水分量は容積重に直ちに影響する。 水分の影響を無くすため、乾燥させた土壌の単位容積当たり質量を容積重(または仮比重)と呼ぶ。容積重は固相の重さに等しい。 容積重は通常1g/cm^3程度であるが、黒ボク土では0.5-0.8g/cm^3である。 3. 三相分布と土壌の重量 三相分布は固相、気相、液相の面積割合。 液相は水分量に左右される→重力水を除去した状態(圃場揚水量)で測定(重力水、圃場揚水量などの用語については6章)。 固相部分のみの比重(真比重)は土壌の種類によらず2.5-2.8g/cm^3程度であるため、固相率の低い土壌ほど比重は軽くなる。 4. 土壌有機物と三相分布 有機物の多い土は団粒構造を作るので空隙が増え、固相率が減る。 5. 土壌粒子の大きさと液相 大きな粒子ばかりからなる土は間隙に水を保持できないため気相率が大きくなりすぎ、干ばつの被害を受けやすい。 逆に気相率の小さな土壌では排水不良を起こしやすい。 理想的な固相率としては 黒ボク土 25-35% それ以外 40-50% 気相率は 黒ボク土 15-20% それ以外 15-25% 6. 土壌の可塑性・粘着性 粘土 力を加えて変形させた後でも形が残っている(可塑性) 砂 可塑性や粘着性が低い 差を生むものは何か? 7. 土壌粒子の大きさと特性 1) 土壌と土性 土性とは? どのくらいの粒径の粒子がどんな割合で含まれているか? 有機物以外の粒子で判定する。 国際法の区分に基づく。 2) 粒径区分と反応特性 礫 2mm以上の粒子。土性判定に含めない。 砂 粗砂と細砂の2つの区分を含む 粗砂 0.2-2.0mmまでの粒子 細砂 0.02-0.2mmまでの粒子 砂が多いほど排水性、通気性大 凝集性には欠ける シルト(微砂) 0.002-0.02までの粒子 粉末のような感じ 粗いものは砂に近い、細かいものは粘土に近い性質を持つ シルトが多いと緻密な土になる 粘土 0.002mm以下の粒子 土壌の物理性と化学的反応に寄与(後述) 8. 土性による土壌分類 粘土、シルト、砂の割合と三角図方を用いて土性区分を決定できる。 9. 土壌の性質を支配する粘土の働き 1) 粘土と比表面積 比表面積とは 物質1g当たりの表面積 比表面積が高まると… 可塑性、凝集性 膨潤性 吸着力 などが高まる。 比表面積は細かい粒子ほど高い。粒径と比表面積は概ね反比例するので、粒径が1/10になれば比表面積は10倍になる。 フォス(1983)の測定によると、 粗砂 23cm^2/g 細砂 91cm^2/g シルト 454cm^2/g 粘土 8000000cm^2/g 2) 粒子相互の調和 粘土が多ければよいのか?→NO 粘土質の土壌は雨が降れば粒子が分散して抵抗が減り、ぬかるむ。 乾燥すれば粒子相互が強固に結びつき、コンクリート状になる。 粘度の高すぎる反応性を緩和し有効に利用するためには砂やシルトとの共存が欠かせない。 10. 粘土と粘土鉱物 土壌は岩石が風化することで 岩石→礫→粗砂→細砂→シルト→粘土 と変化する(細粒化過程)。 岩石(一次鉱物)が重要。 一次鉱物の種類は2000にもなるが、重要なのは次の5つ 長石 石英 輝石 角閃石 雲母 これだけで大陸岩石圏の9割を占める。 一次鉱物が風化過程で変性し、新たにできた鉱物を二次鉱物または粘土鉱物と呼ぶ。 粘土は粒径のみによる区分だが、粘土鉱物はその構成成分に着目した区分をする。 11. 粘土鉱物の種類 1) 層状ケイ酸塩粘土鉱物 2つの基本的層状構造からなる シリカ4面体シート アルミナ8面体シート この2種のシートの重なり合い方により粘土鉱物が3種に分類されている。 2 1型粘土鉱物 スメクタイト、バーミキュライト、イライトなど モンモリロナイト(スメクタイト群)は層間に水が入ることで膨らむ バーミキュライトもやや膨らむ イライトはカリウムが層間に入っているので膨らまない。このカリウムはほとんど利用できない。 2 1 1型粘土鉱物 2 2型とも クロライトは2 1型粘土鉱物の間にマグネシウム8面体シートが入っている。結合が強固なので水で膨らんだりしない。 1 1型粘土鉱物 カオリナイト、ハロイサイトなど シリカ4面体とアルミナ8面体シートが強くつながって結晶になっている。 結合が強いので水で膨らまない。 陶磁器原料に適する 2) 明確な結晶構造をもたない粘土鉱物 アロフェン、イモゴライトなど(いずれも黒ボク土に多く見られる) アロフェン ケイ素とアルミニウムが一定の結合をした準結晶粘土鉱物。有機物の集積、リン酸保持能力、pHによる電気的性質の変化、土壌の軽さなどはアロフェンが原因 3) 鉄、アルミニウムの酸化物・水和酸化物 12. 粘土鉱物の生成と元素の稼働率 1) 粘土鉱物の生成と環境 略
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プラスティックマン(Plastic Man) / パトリック・オブライアン(Patrick "Eal" O Brian)、愛称イール(Eel) (キャラクター、DC) 初出:Quality Comics (1941–1956)、DC Comics (1966–) 属性:化学物質で変異した宇宙人、男性、地球在住 概要 惑星プラスティコンの最後の生き残り。 金庫破りの常習犯だったが、ある仕事の際に化学物質(「酸」としか書いていなかったので、未だに何か分かっていない)を浴びてしまった結果、体がゴムのように延び、自由自在に形が変わるようになった(プラスティックとは「可塑性物質」と言った意味)。元祖ゴム人間。 時には半液状にドロドロになってしまい、ビーカーや瓶に入ることもある。 どのように延びても体に張り付いている赤いコスチュームと、まれにしか外さないゴーグルを着けている。 犯罪者だったが、後に警官やFBIなどの職歴を経る。 性格的に、どんなときも真面目になれずジョークを飛ばし続ける。何にでも変形できる体を使ったギャグ(例えば、手を交通標識に変えて相手に示し、さらにホイッスルをつくって警告するとか)などを用いる。 なお皆驚くのだが、JLA内でプラスティックマンのことを高く買っているのがバットマンである。 同じDCでゴム人間のエロンゲイテッドマンより先に出現しているが、JLに参加したのは近年。 昔の話でよく分からないが、プラスティックマンの版権を買ったことが編集長に伝わっていなくて、編集長が別にエロンゲイテッドマンのコンセプトを指示した、ともいわれている。 エロンゲイテッドマンより液状に近く、グニャグニャになることができる(エロンゲイテッドマンは、あまりグニャグニャになると痛みが出る)。パラシュートができるのがプラスティックマンという違いがあるらしい。 クオリティ・コミックス出身で1941年制作。クオリティ・コミックスが倒産しDCコミックスに買収され、DCのキャラクターになる。 クオリティ・コミックス出身の中でも代表的なキャラクターであり、DCで何回かソロ・タイトルを持つが、あまり長続きしない不遇なキャラだった。 他メディア展開 プラスティックマンが主人公のアニメ"The Plastic Man Comedy/Adventure Show"がつくられており、1979年から1981年まで比較的長く放映された。 「バットマン ブレイブ&ボールド」「ヤングジャスティス」「ジャスティスリーグ・アクション」にそれぞれ登場している。 2020年末、女性版のプラスティックマン(?)を映画にしようという企画が出たとか。 トリビア 日本では、水木しげる御大が貸本漫画時代にライセンス契約して(本当か?)、プラスティックマンを日本で漫画化している。 プラスティックマンがカマボコになるなど、後の鬼太郎につながるアイデアも。 アメコミ@wiki
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. 【作品名】ラジオガール・ウィズ・ジャミング 【名前】ランドロック・ブラウン(本名グレーフレック・カウマン) 【属性】人間、爆弾魔、テロリスト、反政府派武装組織《人民解放同盟》の爆発物製作者 【大きさ】三十歳ほどの細身で長身な成人男性 【攻撃力】鍛えた男性並み、手刀を目の前にいる二人の男性の肋骨の隙間に突き刺し、 息が止まった瞬間を見計らって、追撃で二人を昏倒させた。 仕込みナイフ:狭い通路で有利だったとはいえ、軍刀を持った軍人と互角に斬りあいできるほど。 袖に隠し持っている。 電気信管:C4やダイナマイトの起爆に使う自作信管、複数所持。 タイマーや起爆装置の電波で遠隔起爆できる。 これ単体で爆竹並みの威力があるので、小麦の袋を破裂させたりできる。 可塑性C4 プラスチック爆薬。性能は現実のもの相応。 持ってる量は小さな小包サイズで服に隠し持てる程度。 適度に千切って量を調節して爆発力を変えれる様子。 C4は衝撃を受けても火を点けても爆発しない、信管で起爆させる。 これで倉庫の鍵を破壊したりした。 工業用ダイナマイト:一本持っている円筒の発破、電気信管を埋め込んで投げてから数秒で爆発させる。 数mほどが吹き飛んで焼き爆ぜる。 十数mほどに熱風、爆圧、爆風が起きて、人は倒れて耳が一時的に聞こえなくなる。 ゲル状爆薬:数本のチューブに入れて持っている油中水型乳濁化合物、 ゲル状(エマルション)爆薬を相手に塗りつける。 そして、手にジャケットを巻いて、爆弾で焼けた土をすくって 相手に投げつけて発火点を越えさせて起爆させる。 威力は高性能爆薬並み、鍛えた少女の膝を焼き砕く威力。 【防御力】鍛えた男性並み。 【素早さ】移動・反応は鍛えた男性並みで軍人と同程度。 軍人の斬りつけや格闘攻撃を避けれるぐらい。 【特殊能力】粉塵爆発:いくつかの条件が必要なので使えない、省略。 【長所】爆発物 【短所】ゲル状爆薬の攻撃には手順がいる 【戦法】ダイナマイトやC4を自分に被害がないように投げるか設置して爆破。 あとは格闘しながらゲル状爆薬。 32スレ目 708 :イラストに騙された名無しさん:2009/01/22(木) 00 06 40 ID Q8daSLeU 騎條エリの考察 パトカーと= 香澄霧子>パトカー=騎條エリ>少年> ランドロック・ブラウンの考察 ○宮小路瑞穂~『怪人』 爆弾で勝ち ×香野家のおばあさん 意外に相手が素早い ×蚊子 飛んでるので不利 ○アルマ 爆弾で勝ち ○メイ・カートミル 爆弾で勝ち ×荒木三郎太~矢吹真吾 反応負け、一気に接近されてノックダウンさせられる 香野家のおばあさん>ランドロック・ブラウン>『怪人』 .
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どうでもいいことをつれづれる 1月27日昨日 約1年ぶりのブルースクリーン業界用語的にはスクブル で顔面蒼白且つ顔面ブルースクリーンマリンブルーの風に抱かれて ま、それはおいといて英気を養うのは良い。GOOD。 英気を養う・・・鋭気を養う? 英気?鋭気?映姫? ぼくは映姫がすき。 盈虧もすき。えいきょだと盈虚。盈虧ょというおかしな変換も 今日は1月28日 今今はAM3:11。 もう朝がよい。 今日に備えて寝る。ねるねるねるね 時は満ちた。る。 Teaを飲みたい。だがペットボットル梨の礫。完飲。 BQ P20を抜かし単独TOP ですがどうでもいいです 毎日投稿行きます。やっぱりやめます。 飽きるまで投稿 てか若干秋田。あき竹城。 理由は、もう、言わずもがな、いや言わずもがなではないが モチベの低下。モチベーション低下、昔、モチスターベーションという言葉をジャンプで見た。 熱しやすく冷めやすい。焼け石に水。←これは違う てか追う立場だとやる気ボルテージがMAX振りきってぇ、ビンビンけ!_!なんだが 追われる立場だと如何せんやる気が出ません。そもそも追われてすらない。別にブッチギリ、ケタ違いでステージ数トップというわけでもない。 たしか800差。3000と2200くらい。 それはコメント数TOPにも言えたことで 今頭がオカシイ~ステージはコメ数約100000だったと思うが 2位の名前忘れたはコメ数80000くらい 込めする気が起きないです。もう、 たまーに思い出したようにこめ100くらいするんですが そこまで。試合終了。 もしコメ数なりステージ数の1位のザが陥落し没落。最終的には凋落したら またぱぱぱっと1位狙います。 2年位前にコメ数1位は抜かれたんだけどね。 それも大幅に。 もう抜かさられなさそう。抜かさられなさそうってなんやねん だってだってだっ~っっっっって過疎なんだもん。過疎。過度に疎らってこと。縮めて過疎。ポケモン。可塑性 ここ2・3・4年で急激に過疎ったね。いやもっと前からか。 2012年はまだ人はいたんスガ、なんかもう身内ネタでコーティングされてたよね。 P20と愉快な仲間たちの。傍から見ると塀の中の不愉快な面々。 あそこから既に過疎ナ未来は見えてた。初心者バイバイっぷりがパない。 で、案の定、その人達がサルと。 疎らに過度る。 まとめます。まとめじゃないです。 果たして何年までBQは息してるのか 明日にでも消えてもおかしくない てかいっその事消そう。tkも2012頃に消えたし。 2年後の心中じゃ。一蓮托生。後生大事。 BQが死ぬまで俺は生き続けるから かがみんは可愛い 終 名前 コメント
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【検索用 きゃんてぃーはーふる 登録タグ 2023年 CeVIO き なみぐる コトバッチ 可不 曲 曲か】 + 目次 目次 曲紹介 歌詞 コメント 作詞:N\C、なみぐる 作曲:なみぐる 編曲:なみぐる 絵:コトバッチ(Twitter) 動画:なみぐる 唄:可不 曲紹介 曲名:『キャンディー・パープル』 曲名からは予想できない、歌詞がカオスなネタ曲。 元ネタはAmazonに出品されたある商品の名前。なお、曲名はその商品の色である。 ネタ曲投稿祭2023参加曲で、リスナー投票にて7位を獲得した。 歌詞 (動画概要欄より転載) ゴムゴムゴムゴムパドパドドダダドダダパパドドププブブウウドブブググテチポめめブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブりりブりりりりりりりり (キャンディ・パープル) ブランド N\C 材質 TPE, 熱可塑性エラストマー 色 キャンディ・パープル アイテムいいえ:スイッチ 中国シャツテム Shi Wei:14.5cm [小]、17.5cm [大阪] 形:ウウド カカメちゃちゃちゃ[千]、ノースは↓↓↓して....ノノびノノびぶぱ、ノノびノノびびん☆、ゆっくりゆうじゅうじゅーーーーーーーーーーーーーーーじゅうちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃ= [ゆゆゆ]、キャキャゆゆーーーー~ ゴムゴムゴムゴムパドパドドダダドダダパパドドププブブウウドブブググテチポめめブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブりりブりりりりりりりり (キャンディ・パープル) CANDY PURPLE CANDY PURPLE ネジネジネジネジネジネジネジネジ ゴムゴムゴムゴムゴムゴムゴムゴム ネジネジネジネジネジネジネジネジ ゴムゴムゴムゴムゴムゴムゴムゴム パドパドドダダ ネジネジネジネジネジネジネジネジ ゴムゴムゴムゴムゴムゴムゴムゴム ネジネジネジネジネジネジネジネジ ゴムゴムゴムゴムゴムゴムゴムゴム ゴムゴムゴムゴムパドパドドダダドダダパパドドププブブウウドブブググテチポめめブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブりりブりりりりりりりり りブりりりりりりりり ゴムゴムゴムゴムパドパドドダダドダダパパドドププブブウウドブブググテチポめめブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブりりブりりりりりりりり ゴムゴムゴムゴムパドパドドダダドダダパパドドププブブウウドブブググテチポめめブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブりりブりりりりりりりり(キャンディ・パープル) コメント ゴムゴムゴムゴムパドパドドダダドダダパパドドププブブウウドブブググテチポめめブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブブ -- アイテム いいえ (2023-08-03 15 33 24) カカメちゃちゃちゃ[千]、ノースは↓↓↓して....ノノびノノびぶぱ、ノノびノノびびん☆、ゆっくりゆうじゅうじゅーーーーーーーーーーーーーーーじゅうちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃ= [ゆゆゆ]、キャキャゆゆーーーー~ -- カカメちゃちゃちゃ[千]、ノースは↓↓↓して....ノノびノノびぶぱ、ノノびノノびびん☆、ゆっくりゆうじゅうじゅーーーーーーーーーーーーーーーじゅうちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃちゃ= [ゆゆゆ]、キャキャゆゆーーーー~ (2024-03-04 18 18 42) 名前 コメント
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[有馬田宗ライン] 今のところ、河西先生に渡された資料に名前があった人物なので、呼びやすいかと。。 上田泰己 東大医出身若手のホープ 真のシステムバイオロジスト。。。らしい。 転写システム制御に基づく、サーカディアンリズムの研究。 近藤滋 例のチューリングモデルの人 反応拡散方程式に基づく、体表紋様パターン形成の研究。 影山龍一郎 bHLH型転写因子のoscillationモデルによって、生物時計やsomite形成などの繰り返しパターンに迫る。 [松山ライン] 大抵脳の話となると、脳のココの血流量が~で始まる画像の話、 神経伝達物質や可塑性のメカニズムといった分子のお話が大半を占めるので 今回はちょっと毛色を変えたいと思っています。ミクロとマクロの視点、局所回路とダイナミックなコネクション、大胆な仮説とその実証、など出来るだけこれから夢が広がっていくような話題を選んでいます。 藤井直敬(Naotaka FUJII,Ph.D.) 理研BSI 心と知性研究コア 適応知性研究チームリーダー 理研BSIのHP 研究室のHP 「予想脳」仮説:次に生ずる未来を常に予想して、絶えず流入してくる自動処理された外界環境情報と自己が予想した未来とを比較することが、脳の本質的な機能である --「予想脳 Predicting Brains」岩波科学ライブラリー この予想のもと環境文脈依存的な状態での活動から脳の本来の機能を実証すべくモーションキャプチャーとMRIを対にして、2匹以上のサルを同時計測することにより社会的行動研究をしています。 なにせ千の考え、万の研究結果はあれど、確立された統一的説明がカラッきし無いのでまだ科学になっていない怪しい分野ではありますが、だからこそ面白いですね。講義というか講演のような形のほうが良いかも知れません。 銅谷賢治(Kenji DOYA) 沖縄科学技術大学院大学先行研究事業-銅谷ユニットリーダー ATR脳情報研究所 計算神経生物学研究室 室長 OISTHP 研究室HP ご本人のHP 以下研究室のHPより要約 人間の心の生物学的基盤を、トップダウン的な理論モデルとボトムアップ的な生物学実験の融合により理解することが目的 そのような相互作用を理解するには、脳と環境のダイナミクスを含む数理モデル化と、そのコンピュータシミュレーションやロボット実験が不可欠である。 主要な課題は3つ 1) 細胞や分子、遺伝子の複雑なネットワークをモデル化するための、新たな数理的手法の開発 2)神経修飾物質系の機能とダイナミクスの、神経生理実験による検討 3) 動的な環境下での自己保存、自己複製に必要な適応機構と、その誤動作の可能性のロボット実験による探索 これらを組み合わせることにより、動的システムモデルの新たなソフトウェア、人の感情にも似た高度な適応機能をもつロボット、さらに心の障害の治療と予防のための新たなアプローチの開発をめざす。 名前 コメント
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グンゼ高分子 本店:神奈川県伊勢原市桜台三丁目17番1号 【商号履歴】 グンゼ高分子株式会社(2009年11月~) 郡是高分子工業株式会社(1965年11月~2009年11月) 高分子工業株式会社(1949年3月~1965年11月) 【株式上場履歴】 <店頭>1963年11月 日~2003年7月28日(グンゼ株式会社と株式交換) 【沿革】 昭和24年3月 熱可塑性樹脂成型品製造のため東京都品川区に資本金500千円をもって高分子工業株式会社を設立。 昭和32年11月 松下電器産業株式会社より乾電池用熱収縮性チューブの研究を依頼され、当社独自の研究、生産に入る。また我が国初の塩化ビニール樹脂によるインジェクション成型を行う。 昭和33年8月 収縮チューブの量産体制に入る。 昭和36年12月 前橋工場を前橋市岩神町に開設。 昭和37年9月 アルミサッシガラス押えの大口生産開始。 昭和38年3月 神奈川県伊勢原町に工場用地を買収する。 昭和38年10月 伊勢原工場第一期工事完成、操業開始。 昭和38年11月 東京店頭登録銘柄として株式公開する。 昭和40年11月 郡是製絲株式会社と業務提携、社名を郡是高分子工業株式会社に変更する。 昭和42年6月 伊勢原工場増築完成。本社を東京都品川区から伊勢原町に移転、本社工場とする。 昭和44年8月 資本金を156000千円に増資。 昭和45年6月 前橋工場を前橋市総社町移転新築。操業開始。 昭和46年2月 住友化学工業株式会社、聨合紙器株式会社との合弁により、日本サンプライ株式会社を設立。当社開発によるプラスチック段ボールの生産を開始。 昭和57年12月 経営合理化を実施、前橋工場ほか地方営業所三カ所を閉鎖し、希望退職者を募集。 昭和60年2月 前橋工場土地、建物を売却。 平成4年10月 合弁会社日本サンプライ株式会社に対する合弁を解消。協力会社有限会社コパロン化成増資により、当社連結子会社とする(出資比率80%)。 平成5年10月 有限会社コパロン化成100%子会社となる。 平成8年3月 中国、上海弘達実業有限公司と塩ビチューブ等の製造に関する技術援助契約を締結。 平成9年1月 中国、上海に上記会社との合弁により、上海郡是高分子材料有限公司を設立。 平成9年12月 第三者割当増資により資本金300000千円となり、グンゼ株式会社の子会社となる。 平成10年11月 ギリシャ、SPOROS・S.A.に出資。(出資比率31%) 平成12年12月 ギリシャ、SPOROS・S.A.が増資をし、出資比率15%となり関係会社を外れる。 平成13年1月 中国、上海郡是高分子材料有限公司フィルムの製造・販売を開始 平成14年7月 中国、上海張橋経済発展総公司と平版収縮フィルム等の製造に関する、合作会社設立の契約を締結。設立会社名を上海郡是新塑材有限公司とする。 平成15年3月 グンゼ株式会社との株式交換による、グンゼが郡是高分子の完全親会社となり、郡是高分子がグンゼの完全子会社になる覚書を締結する。